核酸检测技术鉴别转基因食品

肖付刚，谷蒙林，张尧轩，王德国，丁长河，张国治

（1. 许昌学院 食品与药学院，河南许昌 461000；2. 河南省食品安全生物标识快检技术重点实验室，河南许昌 461000；3. 河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450000）

0 引言

自1996年转基因作物被大规模推广以来，全球转基因技术迅猛发展。2019年，全球29 个国家种植了1.904 亿hm2的转基因作物，比1996年增加12 倍[1]。我国对转基因技术的发展也大力支持，国产抗虫棉、抗虫水稻、耐除草剂大豆等都取得了重大进展，目前国内已批准进入商业化种植的转基因作物有转基因棉花和转基因番木瓜[2]。为保障消费者的知情权和选择权， 《农业转基因生物标识管理办法》 规定，我国对转基因产品实行最严格的零阈值强制标识制度。转基因检测作为转基因研究体系中的重要一环，重要性日益凸显。在转基因食品的鉴别中，常用的方法有核酸检测、蛋白质印迹检测、光谱分析、组学分析等。主要对近年来核酸检测技术在转基因技术中的应用、原理、优缺点等方面进行综述，以期从核酸检测方面揭示转基因技术的问题，推进核酸检测技术的研究及在转基因食品检测中的应用。

1 转基因食品现状

转基因食品是通过提取基因片段进行生物基因组重组或人工合成DNA 片段，转入特定生物内使其和生物基因重组，并表现出特定性状和遗传特性[3]。

转基因食品可降低农业成本，提高产量，为农民乃至社会带来巨大的经济效益。但是也有人认为外来基因会破坏食物中的营养成分，存在安全隐患。为消除消费者疑虑，国际权威组织已出台多部评估转基因食品安全性的条例，目前已经形成一套科学、完善的转基因食品安全性评估体系[4]。其中，“实质等同”原则是转基因食品安全性评价的重要原则之一。据我国调查显示，近50%的消费者在购买转基因食品时会谨慎对比和选择，因此对转基因食品进行标识是很有必要的。

2 核酸检测技术在转基因食品鉴别中的应用

随着分子生物学技术的迅猛发展，核酸检测技术被广泛应用于临床医学[5]、物种鉴别[6]、基因检测[7]等方面。在转基因作物检测中，核酸检测技术可以分为3 类：基因芯片、PCR 技术、等温扩增技术。PCR 技术是国标中常用的检测方法[8]。

2.1 基因芯片技术

基因芯片又称DNA 芯片、生物芯片，是20 世纪80年代中期提出来的。其原理是将大量的DNA片段或者寡核苷酸片段密度有序地排列在固相载体上，称为基因芯片；同时提取待检样品的DNA（或mRNA，经逆转录得到荧光标记的cDNA） 探针，与芯片进行杂交，通过扫描芯片上的荧光强度，应用生物信息学方法分析后可获得样品中大量的基因序列和表达水平的信息[9]。基因芯片技术是一种高通量检测方法，应用于转基因检测的报道已有很多，但是该方法耗时长、成本高、探针合成复杂，限制了其推广使用[10-11]。

2.2 PCR 技术

PCR 技术原理类似于DNA 的天然复制过程，通过设计特异性引物使目的基因扩增，包括变性、退火、延伸3 个过程。在转基因作物检测中，PCR 技术被广泛使用，主要包括普通PCR、实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-PCR）、多重PCR（Multiplex PCR），数字PCR（droplet digital PCR）。现就其灵敏度、优缺点总结如下。

常用核酸检测方法的优缺点比较见表1。

表1 常用核酸检测方法的优缺点比较

为使试验结果达到更好的效果，研究人员更倾向于将几种方法相结合。邢珍娟等人[16]建立的多重荧光PCR 不仅适用于转基因玉米成分筛查，也适用于大豆、水稻等多种作物转基因成分筛选鉴定，检测灵敏度可达0.05%。刘二龙等人[17]建立的基于转基因甜菜GTSB77 的双重微滴数字PCR，在20 μL 反应体系中定量下限（LOQ） 均为1.84 拷贝/ μL，检测下限（LOD） 均为0.61 拷贝/ μL，可满足相关部门对GTSB77 及制品的监控、安全评价和风险预警等业务的精准定量的需求。数字PCR 的最新研究是通用LNA 探针介导的液滴数字聚合酶链式反应（ULNAddPCR） 方法，可用于转基因水稻T2A-1，T1C-19，G6H1 的定量分析[18]。

2.3 等温扩增技术

等温扩增技术是一种在PCR 的基础上衍生出来的技术，能够在恒温条件下对目的基因扩增。根据反应原理不同，目前已发展的等温扩增技术有环介导等温扩增（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP） 技术、重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA） 技术、交叉引物等温扩增（Cross Prime Amplification，CPA） 技术、滚环扩增（Rolling Circle Amplification，RCA） 技术等。

主要等温扩增技术及其首次报道时间轴见图1。

图1 主要等温扩增技术及其首次报道时间轴

其中，LAMP 技术在转基因食品的鉴别中应用最为广泛，其次是RPA 技术。CPA 技术是继LAMP 技术后研究的一种新的恒温扩增技术，在转基因检测方面还鲜有报道。RCA 技术是一种简单高效的体外核酸扩增技术，主要用于医疗诊断、环境检测、食品安全等方面。梯形溶解温度等温扩增（Ladder-Shape Melting Temperature Isothermal Amplification，LMTIA） 技术是试验团队在LAMP 技术和PCR 技术的基础上开发的一种新型等温扩增技术，该技术具有高特异性和高敏感度，具有广阔的应用前景[19]。

2.3.1 LAMP 技术

LAMP 技术由日本学者Notomi T 等人[20]发明，而后不断改进，克服了传统PCR 反复升降温且检测周期相对较长的缺点。主要利用4～6 条特异性引物对靶标序列6～8 个区域进行识别，在Bst DNA 聚合酶催化作用下，恒温条件（60～65 ℃） 中实现目的序列的批量扩增[21]。LAMP 技术操作简单、特异性强、灵敏度高，在转基因大豆、玉米、油菜中得到了广泛应用。最新研究，LAMP-TaqMan 能够在65 ℃，20 min 内扩增DNA，已成功用于扩增和检测主要农作物（大豆、玉米、水稻等） 的食物样品中的DNA[22]。利用荧光染料，能够可视化鉴别转基因食品，荧光效果明显，灵敏度甚至可低至0.005%，适用于现场检测[23]。

2.3.2 RPA 技术

RPA 技术是一种新型核酸等温扩增技术，对温度有很强的适应性，在常温下即可完成扩增。其反应原理是在恒温条件下，重组酶与扩增引物结合形成复合物，并在双链DNA 模板中寻找靶位点，定位后就会引发链交换反应并启动DNA 合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增[24]。该方法对设备要求不高，短时间内即可完成扩增。目前，已有多篇关于RPA 技术应用于转基因食品鉴别的报道[25-26]。Wang X F 等人[27]提出了一种基于双重重组酶聚合酶扩增（DRPA） 的快速简便的转基因作物现场检测系统，并与横向流动生物传感器（LFB） 相结合，20～30 min内即可完成检测，缩短了检测时间，减少污染。通过在RPA 反应体系中加入荧光染料，可实现对结果的可视化检测。谢实龙等人[28]建立的MON89788 实时荧光RPA 检测方法，绝对检测限可达到40 拷贝，检测时间仅为实时荧光定量PCR 的0.07～0.13 倍。

2.3.3 CPA 技术

CPA 技术是中国首个具有知识产权的体外扩增技术。CPA 技术是在Bst DNA 聚合酶、扩增引物和2 条交叉引物的作用下完成扩增。通过2 条交叉引物CPF 和CPR 的不断杂交延伸和DNA 聚合酶的链置换作用，使得DNA 拷贝数不断增加，从而达到基因扩增的效果[29]。翟聪聪等人[30]针对转基因水稻Bt63 的3'端边界序列设计5 条CPA 引物进行恒温扩增，可以较好地区分转基因水稻Bt63 和其他品系的转基因水稻及其他转基因生物，具有较好的特异性，检测限可达到0.1%。CPA 技术较LAMP 技术而言不需要昂贵的设备，也避免了EB 等有毒物质；较PCR 而言避免了二次污染，操作简单。但是该技术反应体系复杂、方法不稳定，容易造成假阳性，应用受到了限制。

2.3.4 LMTIA 技术

团队在PCR 和LAMP 技术基础上开发的（LMTIA） 技术[19]，与其他扩增方法相比，LMTIA 技术最大的优势是非热、非酶促单链模板扩增[31-32]。团队已经建立了LMTIA 检测食品中植物源特异性基因建立内标方法，并用于检测肉制品中植物成分，所建立的LMTIA 方法在最优温度57 ℃时，灵敏度为10 pg/μL玉米基因组与10 pg/μL 红枣基因组，可检出肉制品掺入0.1%的玉米淀粉[31]。下一步将开展LMTIA 技术在转基因食品检测中的应用研究，扩展其应用领域。

3 结语

随着科学技术的发展，转基因食品行业发展前景愈发光明。在转基因检测技术日趋成熟的同时，也面临着新的难题，比如转基因食品的基因编辑信息不透明、DNA 片段化等，增加了检测难度。开发高灵敏度、低成本、高通量、检测范围更广的转基因食品检测技术成为未来的发展趋势。对于传统转基因食品检测方法的改进，主要是简化DNA 的提取方法，避免因降解导致的假阴性；提升准确度，开发灵敏度更高、更便捷、成本更低，适用于现场检测的技术。新的转基因检测技术，如电化学DNA 传感器、CRISPR 基因编辑技术给转基因食品检测带来了新的挑战。

总之，新的背景下，还需要提升消费者对转基因食品的认识，用科学、发展的眼光看待转基因食品，相关部门也应该建立更加严格的检测机制，确保转基因食品安全，发挥转基因食品的最大价值。