重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活苗免疫抗体消长规律研究与应用*

陈建豪，买吾兰·孜克牙，杨夷平，杨康，张国新，古丽巴哈·卡德尔，阿达来提·尤素甫，坤巴哈斯·沙合依，马春江

（哈密市动物疫病预防控制中心，新疆 哈密 839000）

高致病性禽流感（Highly pathogenic avian influenza，HPAI）是由H5和H7亚型HPAI病毒感染引起的一种禽类烈性、高度接触性传染病，也是人兽共患传染病[1]，被世界卫生组织列为一类动物疫病。该病不但造成巨大的经济损失，同时也可引起人感染HPAI而死亡，引发人们高度关注。目前世界各国预防HPAI发生的最主要手段是进行疫苗接种，我国主要采取疫苗免疫联合扑杀感染家禽的综合防控措施。

随着基因工程技术如DNA重组技术、反向遗传学技术及基因编辑技术的发展，禽流感疫苗的研发逐渐从传统的灭活疫苗和弱毒活疫苗向基因工程疫苗过渡[2]，但从传统来说，灭活油乳剂疫苗依旧是预防禽流感的首选疫苗，因为它免疫效果好、安全可靠[3]。选择合适的疫苗和合理免疫程序对于HPAI的防控具有重要的意义。本试验选取了三个厂家最新生产的重组禽流感H5+H7三价灭活苗（H5N1 Re-11株+Re-12株，H7N9 H7-Re3株）免疫蛋鸡，通过检测抗体效价研究HPAI免疫抗体消长规律，同时评估免疫效果，根据试验结果筛选最合适的重组禽流感（H5+H7）三价灭活苗，优化免疫程序，为基层疫苗免疫提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

三种重组禽流感病毒H5+H7三价灭活苗疫苗均源于自治区招标采购中标厂家。禽流感（H5N1 Re-11）和禽流感（H5N1 Re-12）病毒抗原批号分别为2020001和2021003，生产厂家均为哈尔滨维科生物技术有限公司。试验动物来自哈密辖区某蛋鸡场。

1.2 试验分组

选取18日龄左右雏鸡240羽，随机分为3组，每组80只。按照免疫方案和疫苗说明书进行免疫注射，18日龄首免，46日龄强化免疫，疫苗免疫后随时观察并记录试验动物的临床表现。具体见表1。

表1 试验蛋鸡分组免疫表

1.3 试验方法

1.3.1 样品采集 分别于25、32、39、46、60、75、105、135、165日龄采集血液样品，每个日龄每组随机抽取30只鸡，18日龄采集40份血液样品，无菌分离血清后-20℃保存。

1.3.2 检测方法与判定 血凝（Hemagglutination test，HA）试验和血凝抑制（Hemagglutination inhibition test，HI）试验根据中华人民共和国国家标准《高致病性禽流感诊断技术》（GB/T 18936-2020）规定的操作规范进行，待检血清HI抗体滴度≥4log2时判为阳性，视为免疫抗体合格。

2 结果与分析

2.1 母源抗体检测结果

18日龄采集40份血清样本做母源抗体检测，禽流感H5N1（Re-11）平均抗体效价为2.38log2，抗体合格率为20%；禽流感H5N1（Re-12）平均抗体效价为2.30log2，抗体合格率为20%；禽流感H7N9（H7-Re3）平均抗体效价为0.75log2，抗体合格率为0%。检测结果表明，此时鸡群母源抗体效价较低，不足于抵抗野毒感染。

2.2 H5N1（Re-11）检测结果

HI抗体效价显示，A、B、C三组在18日龄首免后一周，H5N1（Re-11）平均抗体效价均略微降低，免疫后2周抗体效价开始迅速上升，3周时抗体合格率达到90%，4周抗体效价达到高峰，平均抗体效价在7log2左右，抗体效价差异不大，变异系数最高的A组较最低的C组变异系数高2.85%。A、B、C三组在46日龄二免后二周，H5N1（Re-11）平均抗体效价达到较高水平（9log2以上），抗体合格率达到100%；75日龄时抗体效价达到峰值，随后缓慢下降，变异系数最高的C组较最低的B组变异系数高8.18%。二免后四个月（165 d），H5N1（Re-11）平均抗体效价＞7log2。抗体检测结果见表2。

表2 H5N1（Re-11）株平均抗体效价（log2）检测结果

2.3 H5N1（Re-12）检测结果

H5N1（Re-12）平均抗体效价检测结果与H5N1（Re-12）相似。三组试验鸡在一免后4周抗体效价达到高峰，平均抗体效价在7log2左右，变异系数最高的A组较最低的B组变异系数高3.67%；二免后1个月，抗体效价达到峰值，随后缓慢下降，变异系数最高的C组较最低的A组变异系数高3.01%；二免后四个月（165 d），H5N1（Re-12）平均抗体效价在6log2左右，B组出现单个样品抗体效价不合格。结果见表3。

表3 H5N1（Re-12）株平均抗体效价（log2）检测结果

2.4 H7N9（H7-Re3）检测结果

A、B、C三组在18日龄首免后一周，H7N9（H7-Re3）平均抗体效价均略微上升，3周时抗体合格率达到93%以上，4周抗体效价达到高峰，平均抗体效价在6log2左右，变异系数最高的B组较最低的A组变异系数高0.36%。75日龄时抗体效价达到峰值，随后缓慢下降，变异系数最高的C组较最低的A组变异系数高7.10%。二免后四个月（165 d），H7N9（H7-Re3）平均抗体效价大于7log2。检测结果见表4。

3 讨论

禽流感病毒极易通过变异和重组产生新的毒株，因其感染性和致病性强等对禽业造成严重危害以外，还对人类健康造成巨大的威胁。H5、H7亚型禽流感病毒已在全球60多个国家和地区引起了疫情，人感染H7N9禽流感病毒也时有报道[4-5]。接种疫苗是目前预防和控制禽流感最有效的方式之一，禽流感疫苗的使用对同种HA亚型HPAIV引起的禽流感保护力有所降低，但可有效减轻家禽养殖生产中的临床发病症状，从而降低、甚至避免重大经济损失。刘艳晶等[6]研究表明，使用与疫苗株存在抗原差异的H5N6、H7N9和H5N8亚型毒株攻毒，重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗（H5N1Re-11株+Re-12株，H7N9 H7-Re3株）免疫鸡在攻毒后仍然可以获得临床保护，无明显临床症状，并可有效阻止大多抗原变异毒株在体内的复制。本试验通过研究重组禽流感（H5+H7）三价灭活苗（H5N1 Re-11株+Re-12株，H7N9 H7-Re3株）疫苗免疫家禽后抗体的消长规律，评估免疫后鸡群的抗体水平，为现有疫苗的应用提供基础数据。

本试验中HI抗体效价显示，三组疫苗免疫鸡群后的三个毒株的平均抗体效价基本趋于一致，但三组疫苗初次免疫2周后H5N1Re-11株、Re-12株和H7N9 H7-Re3株平均抗体效价（A组＞B组＞C组）差异较为显著（P＜0.05），随后三组疫苗免疫抗体效价快速上升，趋于一致，分析可能是疫苗佐剂等原因影响疫苗释放有关。随后H5N1 Re-11株、H5N1 Re-12株、H7N9 H7-Re3株在一免后28 d和二免后1个月，各组内和组间平均抗体效价差异较小，变异系数值也较低，差异不显著（P＞0.05），抗体合格率分别为90%以上和100%。结果表明，3个厂家的重组禽流感三价疫苗均具有良好的免疫原性。

免疫程序的选择和优化对于禽流感的防控也起到至关重要的作用。本试验中选择鸡群18日龄首免，母源抗体监测中三个毒株的平均抗体效价均低于4log2，其中H7N9 H7-Re3株抗体效价为0，与刘婷婷等[7]蛋鸡H5、H7亚型禽流感病毒母源抗体消长规律的研究基本一致，一免后一周疫苗保护效力还未形成，存在野毒感染的威胁，所以鸡群的首免时间可以提前至15日龄左右。在禽流感三价灭活苗一免后28 d，此时抗体效价达到高峰，测定的H5N1 Re-11株、H5N1 Re-12株和H7N9 H7-Re3株的抗体效价均在6log2以上，产生的抗体较为均衡；二免后1个月再次升至高峰，达9log2以上，随后缓慢下降；在二免后120 d，H5N1 Re-11株和H7N9 H7-Re3株抗体水平仍维持在7log2以上，H5N1 Re-12株抗体水平维持在5.8log2以上。结果表明，雏鸡一免产生的抗体效价虽然能够有效保护鸡群，但整体的抗体效价不高，对于饲养周期较短的家禽可以免疫一次。对于饲养期较长的种禽、蛋禽，可在一免后28 d强化免疫，可保证鸡群整体的抗体效价保持一个较高水平；同时建议开产前进行1次加强免疫，之后每隔6个月加强免疫一次。