IDH突变调控BMP2、COL27A1和SERPINA5基因表达影响人脑胶质瘤的生存预后

包逸雯 朱伟良

胶质瘤是颅内最常见的原发性恶性肿瘤[1]，预后较差，占所有胶质瘤一半以上的胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）的5、10 年生存率仅在5%、0.71%左右[2，3]。低级别胶质瘤（low-grade gliomas，LGGs）的预后常优于GBM，有些LGGs 亚型的5年生存率在41%～88%[4]。研究表明，异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）突变型胶质瘤病人生存预后相对IDH 野生型胶质瘤病人要好[5]。因此，分析IDH 突变导致的基因表达差异具有重要的临床意义。近年来，成纤维细胞在胶质瘤中的多能性备受关注，包括与其他类型细胞的交联、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的构建以及免疫调节等作用[6～8]。本文拟采用生物信息学方法探讨胶质瘤IDH突变是否通过调控成纤维细胞基因表达抑制胶质瘤恶性生物学行为，从而改善病人预后。

1 资料与方法

1.1 数据收集计算机检索TCGA 数据库（https://por⁃tal.gdc.cancer.），通过UCSC Xena 下载GDC-TCGAGBM 和GDC-TCGA-LGG 相关RNA-seq。648 例胶质瘤（234 例GBM和414例LGG）的RNA-seq数据来自CGGA数据库[9]。此外，从GEO数据库下载单细胞RNA-seq 数据集GSE131928（包含28 例IDH 野生型GBM）[10]。

1.2 差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）的识别CGGA 数据库胶质瘤RNA-seq 数据分 析DEGs 时，P<0.05 和FC>1.5 的 基 因 被 认 为DEGs。TCGA 数据库胶质瘤RNA-seq 数据分析DEGs时，P<0.05和FC>2被认为DEGs。

1.3 基因富集分析通过R 统计软件包clusterProfil⁃er、KEGG.db、clusterProfiler进行GO富集分析、KEGG分析和GESA 相关分析。Entrez 基因id 是从“c2.cp.kegg.v7.4.entrez.gmt”文件中检索到的。

1.4 生存分析首先利用GEPIA（http://gepia.cancerpku.cn/）中的“Expression on Box Plots”模块对肿瘤组织和正常组织的靶基因进行单因素生存分析，Cox比例风险分析和预后模型通过R 统计软件包survmin⁃er、survival、rms、pROC和RColorBrewer进行分析。

1.5 肿瘤纯度、免疫细胞浸润和免疫微环境的评估通过R软件包ESTIMATE、MCPcounter评估胶质瘤样本的肿瘤纯度和肿瘤微环境中基质细胞等比例。

1.6 单细胞聚类分析单细胞RNA-seq 数据集（GSE131928）的细胞聚类由R 软件包Seurat 进行分析。首先，采用“LogNormalize”缩放归一化方法，去除具有超过2 500或<200、>5%线粒体计数的独特特征细胞。在数据归一化后，使用带有默认参数的UMAP执行单元格的非线性降维。最后，通过t-SNE方法和UMAP 方法划分生物标志物簇。此外，通过DEGs的富集分析，再次鉴定出免疫细胞亚群和成纤维细胞亚群。

1.7 数据可视化生信分析结果通过多种R 软件包可视化，包括GOplot、enrichplot、ggplot2、Complex⁃Heatmap、forestplot和ggforestplot等，以及应用Graph⁃Pad Prism 9和Adobe Photoshop 2020等专业软件。

2 结果

2.1 IDH突变显著下调LGGs细胞活性以及与细胞外因子的结合能力GO富集分析显示IDH突变显著下调的DEGs主要参与细胞活力的调节，包括细胞因子受体复合物、免疫复合物等。此外，IDH突变显著抑制LGGs肿瘤细胞与细胞外因子的结合能力，包括细胞因子、趋化因子、ECM成分等。KEGG分析结果再次验证IDH 突变下调ECM 构建相关的通路。信号通路图谱提示这些DEGs 几乎覆盖了ECM 构建通路。IDH突变上调的DEGs也被富集，但并未显著参与ECM 的构建。这提示IDH 突变会削弱肿瘤细胞活力和抑制胞外结构构建，降低肿瘤细胞的侵袭性。

2.2 筛选同时影响LGGs和GBM 生存预后的DEGs GEPIA 数据库的“Survival Plots”模块对IDH 突变产生的DEGs 进行单基因生存分析，成功筛选出超过50 个显著改变LGGs 病人总体生存期的DEGs，12个显著影响LGGs 和GBM 生存预后的靶基因，包括BMP2、COL27A1、SERPINA5 和VEGFA 等（图1A）。多变量coxph 分析发现，TCGA-LGG、CGGA-LGG、TCGA-GBM 和CGGA-GBM 中BMP2、SERPINA5 和COL27A1 表达水平与病人生存预后相关（图1B、1C）。Cox 回归分析显示BMP2 和SERPINA5 的组合比单独BMP2 或SERPINA5 具有更高的预测价值。这提示BMP2、COL27A1和SERPINA5可能是影响胶质瘤病人生存预后的关键基因。

图1 BMP2、COL27A1和SERPINA5的表达水平显著影响胶质瘤病人的生存预后

2.3 胶质瘤IDH突变与BMP2、SERPINA5、COL27A1基因表达水平的相关性CGGA 数据库样本分析结果显示，IDH突变显著下调BMP2在LGGs和GBM中的表达，而显著上调COL27A1 和SERPINA5 的表达（图2A、2B）。这提示IDH突变是改变三个靶基因表达水平的共性条件。相关性分析显示，无论是GBM还是LGGs，BMP2 与COL27A1 和SERPINA5 呈中等强度负相关（图2C、2D），而SERPINA5 与COL27A1呈中等强度正相关（图2C、2D）。

图2 胶质瘤IDH突变与BMP2、SERPINA5、COL27A1基因表达水平的相关性分析

2.4 基质评分和成纤维细胞丰度与胶质瘤预后不良呈正相关免疫估算结果显示COL27A1 和SERPI⁃NA5高表达、BMP2低表达的数据集基质评分明显增高，IDH 突变显著下调四个数据集的基质评分。MCPcounter 评估结果显示IDH 突变和BMP2 高表达显著降低LGGs成纤维细胞的绝对丰度，而COL27A1和SERPINA5高表达显著增加成纤维细胞的绝对丰度（图3）。GBM 成纤维细胞的绝对丰度显著高于LGGs。这提示IDH突变也许通过上调BMP2以及下调COL27A1 和SERPINA5 表达，抑制胶质瘤ECM 的构建和成纤维细胞丰度，最终影响病人的预后。

图3 胶质瘤IDH 基因型以及BMP2、COL27A1、SERPI⁃NA5表达水平与成纤维细胞丰度的关系

2.5 IDH野生型GBM 中成纤维细胞的多能性 包含28 例IDH 野生型GBM 的单细胞数据集（GSE131928）被聚类分析[13]，最后筛选出成纤维细胞亚集。GSM3828672 第8 亚组的富集分析显示成纤维细胞增强内皮细胞、平滑肌细胞等多种细胞的趋化性，并促进微血管的形成；成纤维细胞也可以正向调节上皮细胞向间充质细胞转化并促进间充质细胞增殖和分化。KEGG 分析显示PI3K/Akt、MAPK 和Ras 等信号通路在成纤维细胞中被激活。GSM3828673第11亚组富集分析显示成纤维细胞激活包括脂肪酸代谢、丙酮酸代谢、类固醇代谢等多个能量代谢通路。因此，我们推测成纤维细胞不仅促进ECM的框架构建，还赋予血管内皮细胞和胶质瘤细胞合适的生存环境。这些过程可能是成纤维细胞导致恶性程度最高的IDH 野生型GBM 治疗预后差的因素之一。

3 讨论

即使采用手术联合术后放化疗等综合治疗，几乎所有GBM 仍会复发，中位生存期仅12～15 个月[11]。而IDH野生型LGGs 通常比IDH突变型更早、更快地复发[12]。尽管IDH突变作为保护性因素在胶质瘤治疗中已形成广泛共识，但IDH 的保护性机制仍未完全被认知。为了探讨其潜在机制，我们从CGGA 数据库和TCGA 数据库获取包括LGGs 和GBM 在内的四个数据集，采用多维度多样本的分析，以IDH 突变为切入点，结果显示BMP2、SERPINA5和COL27A1三个基因的表达水平的变化会影响LGGs 和GBM 的生存预后，并与IDH 突变高度相关。这与既往报道较为一致[13～15]。

那么，IDH 突变是如何调控BMP2、COL27A1 和SERPINA5 的表达水平来影响胶质瘤的侵袭性？基于CGGA 数据库相关差异分析的结果表明，IDH 突变下调BMP2的表达，并上调COL27A1和SERPINA5的表达。这提示IDH突变是改变三个靶基因表达水平的共性条件。那么，明确BMP2、COL27A1 和SERPINA5之间是否存在从属关系尤为重要。为此，我们进行相关性分析，结果显示无论GBM 还是LGGs，BMP2 与COL27A1 和SERPINA5 呈中等程度负相关，而COL27A1 和SERPINA5 呈中等强度正相关。此外，热图聚类分析结果与相关性分析结果一致，即三种基因之间找不到绝对从属关系。因此，这三种基因对胶质瘤的影响可能以多元化途径调控肿瘤微环境的变化，例如对免疫微环境的调控，而非直接通过胞内信号通路作用彻底改变肿瘤细胞活力。

BMP2、SERPINA5 和COL27A1 三者之间没有绝对的从属关系，可能更多受IDH突变的影响，并可能以多信号通路的形式调控肿瘤细胞侵袭性。基于IDH突变的富集分析显示细胞外基质构建是IDH突变影响最为广泛的信号通路，而基质构建是影响胶质瘤治疗预后的关键因素之一。我们尝试通过PPI网络来挖掘BMP2、SERPINA5、COL27A1 之间的相关作用以及对上下游关键蛋白节点的调控机制，但是未能有效挖掘。因为PPI 蛋白互动分析是依赖于前人的研究结果，但目前SERPINA5、COL27A1 对肿瘤细胞的影响机制的相关研究仍较少。

总之，我们的结果提示在基因表达水平层面，IDH突变诱导BMP2上调、SERPINA5和COL27A1下调，通过调控肿瘤免疫微环境和成纤维细胞功能活性，降低胶质瘤细胞恶性度。当然，我们基于生物信息学分析得出的相关结论仍需要更多相关领域的研究结果加以论证。