Nrf2信号通路调控自噬对UVA诱导人真皮成纤维细胞凋亡的作用

毛汉潇,刘汝兰,谭自敏,谭小琦,熊霞,何渊民

成纤维细胞是人真皮中主要细胞,在长波紫外线(ultraviolet A, UVA)照射下容易发生各类损伤,导致细胞凋亡及多种皮肤疾病发生[1],但具体机制不清。自噬是一种溶酶体依赖的细胞降解细胞器和大分子物质的过程,可有效维持细胞内环境稳态[2]。既往研究[3]发现,细胞自噬与凋亡的关系密切,多种外源因素可通过不同的机制上调细胞自噬水平,参与调控细胞凋亡,如胞外营养成分发生变化可通过IGF-I/PI3K/mTOR/S6K上调细胞自噬,参与调控如心肌细胞来源的H9c2细胞、人肝癌细胞等细胞凋亡[4]。还有研究[5]发现,UVA照射可诱导细胞氧化应激,激活自噬;抑制紫外线诱导的自噬可以引起细胞凋亡增加。但至今UVA诱导的自噬与细胞凋亡的具体关系及调控机制仍不清楚。在本研究中,笔者拟分析UVA诱导人真皮成纤维细胞凋亡中自噬的作用及可能的调控机制。

1 材料与方法

1.1材料 人皮肤成纤维细胞(中国科学院细胞库);胎牛血清(四季青公司);青霉素-链霉素溶液(×100)、CCK-8试剂盒(碧云天公司);雷帕霉素(RAPA)、ML385溶液(中国MCE公司);FITC Annexin V/PI凋亡试剂盒(美国BD公司);Nrf2 siRNA(美国Dhsrmacon公司);DCFH-DA探针(美国Sigma公司);SUV-1000日光紫外线模拟器(中国上海希格玛有限公司)。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养与建模 在37 ℃含5% 的CO2孵箱内,将人皮肤成纤维细胞置于含有10%胎牛血清1%青链霉素双抗高糖DEME培养基中培养;待生长良好后均匀接种于6孔板中培养,将6孔板于冰上用紫外线模拟器以8 J/cm2的UVA进行照射,照射结束后置于孵箱中继续培养。

1.2.2细胞分组处理 细胞随机分为对照组、UVA组、雷帕霉素(RAPA)组、3-甲基嘌呤(3-MA)组、ML385组和Nrf2 siRNA干扰(siRNA)组。RAPA组和3-MA组分别加入稀释后的母液100 nmol/L和50 μmmol/L。除对照组外,其余各组经不同试剂预处理2 h后用紫外线模拟器以8 J/cm2的UVA进行照光处理。

1.2.3细胞转染 siRNA片段成纤维细胞接种于含无抗培养基的24孔板中,待细胞密度达80%时进行转染。转染步骤按试剂盒说明操作。

1.2.4细胞活性检测 细胞经消化、离心后,将细胞悬液密度重调为2×104个/mL时将细胞接种于96孔板中,分别于每孔中加入10 μL CCK-8溶液后于酶标仪测量450 nm处的吸光值。

1.2.5细胞凋亡检测 各组细胞经光照造模处理后,经消化、离心后,采用Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡情况。

1.2.6Western blot检测 各组细胞经使用裂解液刮取细胞,离心,收集上清液并用BCA法测定目标蛋白的浓度。进行蛋白电泳,随后通过湿法转膜。5%脱脂牛奶中室温封闭2 h后孵育一抗4 ℃过夜,用TBST液体清洗后室温孵育二抗1 h。显影曝光,采集图像并灰度分析。

2 结果

2.1UVA诱导人皮肤成纤维细胞凋亡 与未照射组(0 h)相比,成纤维细胞经8 J/cm2剂量的UVA光照4 h后细胞形态变化最大。CCK-8检测结果显示,成纤维细胞经UVA照射时间延长细胞活性逐渐降低,组间比较差异有统计学意义(F=93.182,P<0.01)。流式细胞术结果显示,随着照射时间的延长,细胞凋亡比例增高(F=37.484,P<0.01),见图1。

2.2UVA诱导成纤维细胞自噬水平变化及对凋亡的影响 除对照组外,以8 J/cm2UVA照射UVA组、RAPA组及3-MA组后,CCK-8检测结果显示,细胞活性从高到低的顺序依次是对照组、RAPA组、UVA组、3-MA组,组间比较差异有统计学意义(F=66.826,

P<0.01)。流式细胞术结果显示,自噬促进剂RAPA预处理细胞后,细胞凋亡率显著低于UVA组(P<0.01);而自噬抑制剂3-MA预处理细胞后,细胞凋亡比例显著高于其他各组(P<0.01),各组之间比较差异有统计学意义(F=88.654,P<0.01)。Western blot检测各组成纤维细胞中的自噬关键分子LC3、p62及细胞凋亡相关蛋白Cleaved Caspase3的表达变化情况,结果显示,与对照组相比,细胞经UVA照射后LC3Ⅱ/Ⅰ比值增大、p62表达降低,Cleaved Caspase3表达显著增加;而RAPA组较UVA组的LC3Ⅱ/Ⅰ比值增大、p62减少,胞内Cleaved Caspase3表达显著降低;3-MA组较UVA组的LC3Ⅱ/Ⅰ比值减小、p62增多,Cleaved Caspase3表达明显升高。LC3Ⅱ/Ⅰ比值、p62及Cleaved Caspase3在4组中的比较差异有统计学意义(F=35.570、191.844、77.857,P<0.01),见图2。

Note:Compared with control group, *P<0.05, **P<0.01; compared with UVA group,△P<0.05,△△P<0.01.

2.3Nrf2信号通路调控自噬参与UVA诱导的人皮肤成纤维细胞凋亡 与对照组相比,UVA组胞核内Nrf2的表达明显增多;Nrf2抑制剂处理后的ML385组胞核内Nrf2的表达降低,并且胞浆LC3Ⅱ/Ⅰ降低、p62蛋白减少,Cleaved Caspase3蛋白增加,Nrf2、LC3Ⅱ/Ⅰ比值、p62及Cleaved Caspase3在3组中的比较差异有统计学意义(F=86.366、55.815、172.715、137.363,P<0.01)。使用Nrf2 siRNA干预Nrf2表达后,观察到了与Nrf2抑制剂处理相似的结果,即胞浆p62蛋白、LC3Ⅱ/Ⅰ减少,Cleaved Caspase3蛋白增加(F=425.029、57.871、412.902,P<0.01),见图3～4。

3 讨论

紫外线辐射可以引起皮肤损伤,紫外线中95%为UVA,可到达皮肤真皮层,诱导真皮中主要成分成纤维细胞损伤[6],该过程与皮肤老化和损伤后修复息息相关[7],目前国内外对UVA引起成纤维细胞自噬和凋亡的研究较少,明确UVA对成纤维细胞损伤机制对于减缓成纤维细胞的光损伤甚至逆转细胞结局有重要价值。在本研究中观察到以8 J/cm2UVA照射成纤维细胞后,细胞凋亡增加、活性下降。有研究[8]表明,UVA照射可增加凋亡转录因子的产生促进凋亡发生,其对成纤维细胞的凋亡作用具有剂量依赖性,剂量越大,细胞凋亡率越高,如侯巍等[9]在研究中发现,UVA≤10 J/cm2照射时成纤维细胞的凋亡率不高于15%,剂量≥20 J/cm2时细胞凋亡率已达50%左右。在相同UVA剂量照射下,Godar等[10]在UVA照射成纤维细胞后分别分离凋亡DNA,在2 h时发现第一梯度出现,4 h时出现“梯化现象”,8 h及之后时间与4 h相比没有明显增加,进一步研究发现可能与UVA损伤细胞DNA和下调Bcl-2的作用时间相关[11]。

生理状态下,细胞自噬是细胞的自我防御与修复过程,对维持细胞内环境稳态十分重要[12-13],目前国内外许多亚领域学者致力于探究自噬的相关机制为衰老[14]、退行性变[15]等疾病提供新思路。氧

Note:Compared with control group, *P<0.05, **P<0.01; compared with UVA group,△P<0.05,△△P<0.01.

Note:Compared with control group, *P<0.05, **P<0.01; compared with UVA group,△P<0.05,△△P<0.01.

化应激与自噬激活密切相关[16-17],有研究表明[8],UVA照射可激活自噬保护细胞,以减少紫外线对角质形成细胞的损害。在本研究中,笔者观察到成纤维细胞经UVA照射后,LC3Ⅱ/Ⅰ比值增加,p62含量下降,表明UVA照射可上调成纤维细胞自噬水平。既往研究[18]发现,在细胞处于应激时胞内自噬水平会升高,以降解损伤的细胞器和凋亡相关蛋白抑制凋亡;也有报道[19]发现当细胞出现高水平自噬可以促进凋亡。本实验使用3-MA抑制自噬后,用同等剂量的UVA照射成纤维细胞,发现细胞凋亡率及细胞凋亡相关蛋白Cleaved Caspase3明显增加;使用RAPA促进自噬后,发现细胞凋亡率及细胞凋亡相关蛋白Cleaved Caspase3显著下降。结果表明UVA照射后促进成纤维细胞自噬可以显著抑制细胞凋亡。

研究[20]发现,UVA照射后细胞内Nrf2及其下游信号可被激活,Nrf2通路与氧化应激相关,还有研究[21]也指出Nrf2通路对细胞自噬和凋亡均有调节作用。Hirota等[22]研究发现,敲除Nrf2基因后,成纤维细胞经UVA照射其细胞凋亡数明显增加。在本实验证明UVA照射成纤维细胞后可诱导Nrf2入核,采用Nrf2抑制剂ML385阻断Nrf2入核及使用siRNA抑制Nrf2表达后,此时的p62表达较UVA组下降,表明Nrf2核转位可以调控p62的表达,这一结果提示p62可能是Nrf2信号的下游分子;此外,笔者发现抑制Nrf2入核后UVA照射成纤维细胞时Cleaved Caspase3蛋白含量较UVA组增加,证明Nrf2核转位可以抑制UVA照射后成纤维细胞的凋亡,但是UVA照射后激活Nrf2入核诱导自噬调控成纤维细胞凋亡的完整过程及调控仍然有待深入研究。综上,笔者的研究发现,UVA照射可以激活Nrf2/p62信号通路上调细胞自噬水平,细胞自噬可以抑制UVA诱导的成纤维细胞凋亡。本研究结果可能为光损伤性皮肤病的发病及治疗提供新方向,但未来尚需对Nrf2信号通路在UVA致成纤维细胞凋亡过程进行深入研究以更好的阐明Nrf2-自噬轴对细胞凋亡的调控作用。