两种厂家碱性磷酸酶性能评估

王玉堂，逯阵毫，马明，闫淼，陈永奇，渠海

（郑州安图生物工程股份有限公司，河南 郑州 450016）

近年来，化学发光免疫分析（chemiluminescence immunoassay,CLIA）发展如火如荼，该分析方法是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。在化学发光免疫分析平台中，有辣根过氧化物酶-鲁米诺体系、碱性磷酸酶-3-（2'-螺旋金刚烷）-4-甲氧基-4-（3"-磷酰氧基）苯-1,2-二氧杂环丁烷体系［1-2］、吖啶酯-H2O2体系等，其中碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AP）是一种水解酶，在碱性环境中能水解很多磷酸单酯化合物。该酶的用途广泛，它可以作为某些疾病的标志物，也经常用于在酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）中标记抗体或抗原，进而帮助检测相应的抗原或抗体的含量［1］。然而碱性磷酸酶来源于多种渠道，比如大肠杆菌、小牛肠等，而不同厂家的提取工艺又千差万别，这就导致市场上碱性磷酸酶的活性鱼龙混杂，能应用于化学发光免疫分析领域的碱性磷酸酶需要仔细甄别和评价。为此，我们通过化学发光免疫分析的方法评估了商业化的不同厂家的AP，甄选出厂家S 的碱性磷酸酶能够较好地应用于化学发光免疫分析。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

碱性磷酸酶A01B03-X（厂家C）、碱性磷酸酶A01B03-X1（厂家C）、碱性磷酸酶S1（厂家S）、4-（N-马来酰亚胺基甲基）环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯（SMCC，sigma）、2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐（aladdin 生产）、磁微粒促甲状腺激素混悬液（厂家A）、磁微粒促甲状腺激素酶稀释液（厂家A）、全自动免疫检验系统用底物液（厂家M），磁微粒促甲状腺激素校准品（厂家A），内分泌质控（厂家A），促甲状腺激素（TSH）抗体（厂家A）；磁微粒促甲状腺激素检测试剂盒（厂家M）。全自动化学发光分析仪（CL-2000i，厂家M）；全自动化学发光分析仪（型号A2000PLUS，厂家A）。

1.2 方法

碱性磷酸酶-抗体标记物的制备：目前常用的用于蛋白质交联的交联剂种类繁多，比如同端双功能交联剂有：戊二醛、双琥珀酰亚胺辛二酸酯钠盐、双琥珀酰亚胺戊二酸酯、3,3'-二硫代二丙酸二（N-羟基丁二酰亚胺酯）、二（N-琥珀酰亚胺）乙烯乙二醇二琥珀酸酯；异端双功能交联剂有：3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯、6-（马来酰亚胺基）己酸琥珀酰亚胺酯、4-（N-马来酰亚胺基甲基）环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯等。但被成熟应用的主要有戊二醛、马来酰亚胺-琥珀酰亚胺系列交联剂。这两种交联剂都属于双功能交联剂，在交联过程中可避免破坏蛋白质的自身结构，不影响其生物活性。本实验室重点对琥珀酰亚胺基-［4-（N-马来酰亚胺甲基）］-环己烷-1-甲酸-（6-氨基己酸酯）（LC-SMCC）的交联方法［3］做了探索，并优化出了一套较为成熟的AP 标记工艺，其过程如下（以下称为LC-SMCC 法）：①AP的马来酰胺化。取1.9 mg，溶于190 μL DMSO 中；用PBS 溶解AP，并调整浓度至5 mg/mL；将5 μL LC-SMCC 溶液和10 μL AP 溶液相混合，在25℃下孵育2 h；再将溶液转移至透析袋，在pH 7.0 的PBS 透析6 h，期间更换一次透析液；取出透析物，备用。②促甲状腺素抗体的巯基化。将单抗用pH 7.0 的PB 调整至2.5 mg/mL；将2 μL 的ITL水溶液（10 mg/mL）加入到100 μL 的促甲状腺激素单抗PBS 溶液中（2.5 mg/mL），混匀后调节pH 8.0，在室温25℃下振荡反应2 h；再将溶液转移至透析袋，在pH7.0 的PBS 透析6 h，期间更换一次透析液；取出透析物，备用。③标记和纯化。将马来酰胺化的AP 和巯基化的单抗混合，在室温25℃振荡反应2 h；取出加入等体积甘油，存放2～8℃备用。

1.3 几种碱性磷酸酶标记物性能评价

将3 种碱性磷酸酶标记的TSH 抗体搭配磁珠试剂制备成3 套工作试剂，分别在厂家A 全自动化学发光测定上按样本100 μL、磁珠试剂20 μL、酶试剂50 μL 的加样量，以一步法测试磁微粒TSH项目。

1.3.1 校准品梯度以及信号值评价 将厂家A 磁微粒TSH 试剂的校准品分别用上述3 套工作试剂进行检测，可得到三种碱性磷酸酶用同一种工艺进行抗体标记后的校准品梯度和信号值，其中抗体-碱性磷酸酶偶联物用厂家A 酶稀释液稀释2 000 倍。

1.3.2 灵敏度考核 连续测定20 次浓度值为0 的校准品S0，计算发光值的平均值（average,AV）和标准差（standard deviation,SD），在校准曲线上回算出信号值M+2SD 的浓度值，即为最低检测限。最低检测限是一个试剂盒灵敏度最关键的指标。

1.3.3 精密性考核 将厂家A 内分泌质控成品（其中包含高值约1 000 mIU/mL、中值约100 mIU/mL、低值约10 mIU/mL），用自制的磁微粒TSH 碱性磷酸酶检测试剂进行测试，测试方案为：第一天分别高中低值质控品各5 孔，第二天、第三天、第四天、第五天分别测试高中低值质控品各两孔，计算第一天各个浓度值5 个信号值的变异系数（coefficient of variation,CV），即得到试剂盒的分析内精密性，然后计算每个浓度值13 个信号值的变异系数，即为试剂盒的分析间精密性。

1.3.4 不同试剂盒临床对比 ①取10 份临床样本按照标准处理，无溶血或脂血现象，在-20℃保存不超过三周；②经厂家M 公司促甲状腺激素检测试剂盒（碱性磷酸酶促发光法）测定；③在0～30 mIU/mL 范围内均匀分布。

2 结果

2.1 不同碱性磷酸酶所建试剂盒的信号值以及校准品梯度

将不同碱性磷酸酶标记TSH 抗体，制成三个磁微粒TSH 检测试剂盒，并进行校准品信号值以及梯度对比，见表1。

表1 不同AP 标记抗体后试剂盒发光值对比

从表1 中可知：厂家S 碱性磷酸酶制备的试剂盒不仅本底较低，灵敏度较高，且信号值最高达到五百万；而厂家C 碱性磷酸酶试剂盒本底均较高，且灵敏度较低，信号值均不超过三百万，显然，这两个试剂盒是不足以应用的。接下来，只评价厂家S 碱性磷酸酶试剂盒。

2.2 灵敏度考核

分别由厂家S 的碱性磷酸酶S1 和厂家C 的碱性磷酸酶A01B03-X、A01B03-X1 标记TSH 抗体而得的酶试剂测定所得的最低检测限为0.01 mIU/mL、0.16 mIU/mL、0.06 mIU/mL。因此本指标中厂家S 的碱性磷酸酶S1 最优，而与厂家C的A01B03-X1 次之，厂家C 的碱性磷酸酶A01B03-X 最差。

2.3 精密性考核

通过以上两个性能指标的考核，确定厂家S的碱性磷酸酶S1 标记TSH 抗体得到的酶试剂最优，故精密性只进行该酶试剂的考核。进行精密性考核后得到该磁微粒TSH 检测试剂盒的高中低质控分析内精密性分别为2.64%、1.75%、1.68%，分析间精密性分别为2.70%、1.96%、1.32%。该试剂盒的精密性性能满足体外诊断试剂的国家要求。见表2。

表2 厂家S 碱性磷酸酶试剂的精密性考核（%）

2.4 临床相关性

征集10 例按照样本处理要求处理的血清样本，分别用厂家A 磁微粒TSH 检测试剂、厂家M磁微粒TSH 检测试剂、由厂家S 碱性磷酸酶S1 标记TSH 抗体制成的磁微粒TSH 检测试剂测定，计算结果后比较彼此之间临床相关性，见图1～3、图1 以厂家A 磁微粒TSH 试剂测定结果为横坐标，厂家M 磁微粒TSH 试剂测定结果为纵坐标；图2 以厂家A 磁微粒TSH 试剂测定结果为横坐标，自制碱性磷酸酶磁微粒TSH 试剂测定结果为纵坐标；图3 以自制碱性磷酸酶磁微粒TSH 试剂检测结果为横坐标，厂家M 磁微粒TSH 试剂检测结果为总坐标，分别作两组结果的相关性方程，并计算相关性系数R2。

图1 厂家A 磁微粒TSH 试剂与厂家M 磁微粒TSH 试剂临床相关性

图2 厂家A 磁微粒TSH 试剂与厂家S 碱性磷酸酶自制磁微粒TSH 试剂临床相关性

图3 厂家M 磁微粒TSH 试剂与厂家S 碱性磷酸酶自制磁微粒TSH 试剂临床相关性

通过对比三个试剂盒的临床相关性可以得知，自制磁微粒TSH 检测试剂与另外两个市售的磁微粒TSH 检测试剂盒在临床相关系数R2上均能达到0.9 以上，初步说明自制磁微粒TSH 检测试是可以在临床上应用的。

3 讨论

综合以上评价结果，可以初步看出厂家S 的碱性磷酸酶活性较高，其来源于小牛肠膜［4］，较适合用于化学发光诊断试剂，厂家C 的两批次碱性磷酸酶活性较低，信号值不能满足化学发光试剂的临床需求。而用厂家S 的碱性磷酸酶标记TSH 活材制得的磁微粒TSH 检测试剂在各个方面的性能均表现较好并得到验证，该碱性磷酸酶可用于临床用化学发光诊断试剂的开发。

碱性磷酸酶已被广泛用于化学发光诊断试剂，其是一种水解酶［5］，它的酶学性质已经被广泛的研究，特别是对于从不同的来源中提取的碱性磷酸酶，在Km、Vmax、最适pH 和最适反应温度等基本性质方面进行了不同程度的深入研究。不同来源的碱性磷酸酶，其蛋白质空间结构，活性等有很大不同，目前初步推测以上三种碱性磷酸酶之所以表现出较大的差别，是不同结构导致的，还需进一步更加详细的研究。