基于网络药理学与分子对接探讨火把花根干预IgA 肾病的作用机制研究

钟秀玉，张建

（1.河南中医药大学儿科医学院，河南 郑州 450000；2.河南中医药大学，河南 郑州 450000）

IgA 肾病（IgA nephropathy, IgAN）是指肾小球系膜区以IgA 或IgA 为主的免疫复合物沉积为主要特点的肾小球疾病，是目前世界范围内最常见的原发性肾小球疾病，亦是CKD 和肾衰竭的首要病因之一，约25%~30%的患者在20~25 年内可缓慢进展至肾衰竭[1]。IgAN发病有着明显的地域差异，亚洲国家的发病率明显高于欧洲、美洲、非洲等国家，我国经肾活检确诊的IgAN 占原发性肾小球疾病的45%以上[2]。虽然IgAN在人群中有着较高的发病率，但目前我们对其发病机制的认识仍十分有限，以至于针对IgAN 尚缺乏特异性的治疗方法，现以RAS 抑制、严格控制血压等支持治疗为主。因此，积极探索IgAN 的发病机制并寻找切实有效的治疗方法显得尤为重要。

火把花[Tripterygium hypoglaucm(Levl.)Hutch]为卫矛科雷公藤属植物，又名昆明山海棠、断肠草、紫金皮等，是中成药火把花根片的主要药源。火把花根片由“昆明山海棠”去皮的根芯加工而成，有祛风除湿、舒筋活络、清热解毒等功效。同雷公藤属植物雷公藤一样，属于中药免疫抑制剂，临床广泛应用于各种肾小球疾病，大量研究显示，火把花根片能有效控制蛋白尿、改善肾功能[3-6]。现代药学研究显示，火把花根含有生物碱、萜类、皂苷、内酯、色素等多种化学成分。药理实验证明，该植物具有抗炎、抗生育、免疫抑制、抗癌、镇痛等作用[7-9]。但目前就其干预IgAN 的作用机制尚不完全清楚。

网络药理学（Network pharmacology,NP）由Andrew L.Hopkins 教授于2007 年首次提出，有别于传统药理学研究模式，网络药理学基于系统生物学和生物网络的构建，揭示了药物与疾病之间多靶点、多途径、多通路的分子机制[10,11]。这一概念与传统中医药学的“整体观念”、“辨证论治”和“方剂干预”原则不谋而合，国内李梢教授从生物分子网络角度出发，自主研制了一套中药网络药理学研究方法，先后阐释了中医证候、方药的微观生物网络及作用机制[12]。目前网络药理学已成为中医药现代化研究的重要且成熟的方法及理论。基于计算机模拟技术进行的分子对接操作，能够预测配体与生物大分子之间的相互作用模式，并评估两分子之间的结合，是药物研发过程中重要的虚拟筛选途径[13,14]。本研究正是基于网络药理学及分子对接技术，从分子水平探讨火把花根干预IgAN 的作用机制。

1 材料与方法

1.1 火把花根相关成分及靶点预测

综合检索相关文献并收集火把花根化合物成分及结构信息，利用Pubchem 数据库下载化合物结构式或直接参照文献中化学结构式利用Chemdraw 画出，结构式均以sdf 格式保存。将所获得的分子结构式输入SwissADME平台[15（]http://www.swissadme.ch） 进行类药性筛选，核心化合物筛选标准设置为：①肠胃吸收（Gatrointestinal absortion；GIabsortion）为“High”，表明该成分具备良好口服生物利用度；②设置5 类药性预测（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）结果中有2个及2 个以上为“Yes”，表明该化合物具有较佳的药代动力学特征。其中不符合筛选标准的化合物，进行文献查阅核查，若化合物药理作用明显与研究主题相关，仍予以纳入，最终获得火把花根潜在核心化合物。然后利用Pharmmapper数据库[16（]http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）基于药效团映射进行靶点预测，并选择Normalized Fit Score（NF）≥0.5 的蛋白作为药物预测靶点。

1.2 IgAN疾病靶点预测

利用GeneCards数据库[17（]https://www.genecards.org/）、DisGeNet数据库[18（]https://www.disgenet.org/）、OMIM数据库[19（]Online Mendelian Inheritance in Man）（https://www.omim.org/）、DRUGBANK 数据库[20]（https://go.drugbank.com/），以“IgA nephropathy”、“IgAN”为检索词进行检索获取IgAN 相关疾病靶点。将获取的疾病靶点汇总并删除重复值。利用Uniprot数据库将预测到的药物和疾病靶点名称统一规范为Genesymbol，通过R4.2.0ggvenn包对火把花根与IgAN相关靶点进行交互映射，最终获得火把花根干预IgAN的潜在靶点。

1.3 火把花根成分-IgAN靶点PPI网络构建

蛋白交互作用网络（Protein-protein interactions,PPIs）的构建旨在透过蛋白质交互作用从分子生物学角度阐释蛋白质在细胞中的生化功能。将“火把花根”“IgAN”共同靶点上传至STRING11.5 数据库[21]（https://stringdb.org/），选择“智人”物种，并将蛋白互作关系置信分数设置为中等置信度（score≥0.4），以获得PPI 网络。利用Cytoscape 3.9.0 软件[22]对PPI 网络图进行分析，并使用cytohubba 插件[23]、MCODE 插件[24]筛选核心靶点及子网络。

1.4 火把花根成分-IgAN靶点GO、KEGG生物富集分析

利用R4.2.0 clusterProfiler 包[25]基于org.Hs.eg.db注释包及KEGG在线数据库注释（https://www.genome.jp/kegg/）对交集靶点进行GO（Gene Ontology）与KEGG（Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes）生物富集分析及功能注释，其中GO 注释包括生物学过程（Biological process,BP）、细胞组分（Cellular component, CC）与分子功能（Molecular function, MF）。根据矫正后p 值（p.adjust）从小到大进行排序，最终选取排在前10 位的富集结果。

1.5 火把花根成分-靶点网络图构建

将火把花根单体成分与火把花-IgAN相关靶点进行匹配，上传至Cytoscape 3.9.0 构建成分-靶点信息网络图。利用软件内置工具“Analyze Network”对网络进行分析并获得相关网络拓扑参数值，包括节点的度（Degree）、接近度（Closeness）、介数（Betweenness）等，以用来寻找网络中重要的成分及靶点信息。

1.6 分子对接评估

对“1.5”项下获得的核心成分和靶点（Degree值排名前六）进行分子对接。利用pubchem、Chem3D 20.0优化（结合能最小化）并保存核心成分3D 结构（mol2格式）；利用RCSB PDB 数据库[26（]https://www.rcsb.org/）下载核心受体蛋白晶体结构（pdb 格式）。使用AutoDockTools 1.5.7 对受体蛋白进行加氢、计算原子局部电荷、判断原子类型的处理，并对小分子配体加氢、计算局部电荷（Partial charges）、设置可旋转配体键；最后将处理后的配体、受体结构保存为pdbqt 格式。使用AutoDock Vina 1.1.2[27]执行分子对接预测，依据对接结果中Affinity 值评估小分子配体与受体蛋白的结合情况。

2 结果

2.1 火把花根主要活性成分及靶点预测结果

以“火把花”、“昆明山海棠”、“成分”为关键词通过知网进行检索，阅读整理相关文献[28-31]，最终共获得43 个与火把花根相关的化合物成分信息，包括“雷公藤晋碱”、“雷公藤春碱”等生物碱类；“雷公藤甲素”、“雷藤二萜醌A”等二萜类；“雷公藤红素”、“雷公藤内酯甲”等三萜类以及其他黄酮类、糖苷类、脂肪酸类等成分。根据类药性原则通过SwissADME 平台共筛选出19 种潜在活性成分（表1），部分成分结构式见图1。利用PharmMapper 数据库预测并选择NF≥0.5 的靶蛋白作为成分靶点，汇总并去除所有重复值，最终共筛选出285 个药物靶点。

表1 火把花根潜在活性成分Table 1 Potential active ingredients of the Tripteryium hypoglaucum root

图1 部分化合物结构式Fig.1 Structural formula of some compounds

2.2 火把花根干预IgAN潜在靶点获取

以“IgA nephropathy”、“IgAN”为检索词进行检索，在Genecards 数据库、OMIM 数据库、Disgenet 数据库、Drugbank 数据库中分别获得647 个、178 个、458 个、20 个疾病相关靶点。整合各数据库所获靶点，合并汇总并删除重复值，最终共得到937 个与IgAN相关的疾病靶点。利用R4.2.0ggvenn 包对285 个火把花根中药靶点与937 个IgAN 疾病靶点进行交互映射，获得54 个中药疾病共同靶点，并绘制VENN图，见图2。

图2 药物靶点和疾病靶点韦恩图Fig.2 Venn diagram of drug targets and disease targets

2.3 PPI网络构建

将54 个共同靶点上传至STRING11.5 数据库建立蛋白互作网络图，并导入Cytoscape 3.9.0 利用Analyze Network 工具计算网络拓扑参数，依据节点度值（Degree）及边的结合分数（Combined score）对PPI 网络进行调整最终得到蛋白互作网络图（图3），其中节点颜色越深、面积越大、透明度越高，其degree 越大，边的颜色越深、宽度越大、透明度越高，其combined score 越大，二者均表明该节点在网络中更重要。利用cytohubba 插件依据MCC 算法筛选排名前十的核心靶点（表2），利用MCODE 插件对PPI 网络进一步分析，筛选保存核心子网络，见图4。

表2 火把花根-IgAN“MCC”评分排名前十的核心靶点Table 2 Top ten core targets of Tripterygium hypoglaucum Root-IgAN"MCC"score

图3 火把花根-IgAN 靶点PPI 网络Fig.3 Tripterygium hypoglaucum Root-IgAN target PPI network

图4 火把花根-IgAN 靶点PPI 网络中的子网络模块Fig.4 The module in the Tripterygium hypoglaucum Root-IgAN target PPI network

2.4 GO功能富集和KEGG通路富集

利用R4.2.0 clusterProfiler 程序包对火把花根干预IgAN 靶点进行生物信息富集分析及功能注释，见图5。GO 富集结果显示潜在靶点主要参与伤口愈合（Wound healing）、激素代谢过程（Hormone metabolic process）、白细胞黏附（Leukocyte cell-cell adhesion）等生物进程；主要定位在囊泡腔（Vesicle lumen）、分泌颗粒管腔（Secretory granule lumen）、血小板 颗粒（Platelet alpha granule）等细胞结构上；主要的分子功能涉及肽酶活性（Peptidase activity）、丝氨酸水解酶活性（Serine hydrolase activity）、磷酸酶结合（Phosphatase binding）等。KEGG通路主要富集癌症中的蛋白聚糖信号通路（Proteoglycans in cancer pathway）、脂质和动脉粥样硬化信号通路（Lipid and atherosclerosis pathway）、FoxO 信号通路（FoxO signaling pathway）等。

图5 火把花根干预IgAN 潜在靶点富集分析Fig.5 Enrichment analysis of potential targets of Tripterygium hypoglaucum roots intervention in IgAN

2.5 火把花根成分-靶点网络构建

利用Cytoscape3.9.0 构建火把花根成分与靶点信息网络图，并根据网络拓扑学参数获得核心成分及靶点信息。如图6 所示，该网络共包含73 个节点、485 条边，节点面积越大、颜色越深代表度值（Degree）越高，即该成分、靶点在网络中越重要。其中雷公藤内酯甲、雷公藤春碱、雷公藤内酯乙、雷公藤红素等为火把花根干预IgAN 的核心成分；周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）、醛糖还原酶（AKR1B1）、凝血酶（F2）、丝裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）等为潜在的核心靶点。

图6 火把花根干预IgAN 成分-靶点网络图Fig.6Tripterygium hypoglaucum roots interferes with IgAN components-target network diagram

2.6 分子对接结果

利用AutoDock Vina 对“1.5”项下degree 值排名前6的核心成分（wilforlide A、wilfortrine、wilforlide B、Celastrol、triptobenzene H、wilforgine）及靶点CDK2（PDBID：1gz8）、AKR1B1（PDBID：1us0）、F2（PDBID：3po1）、MAPK14（PDBID：2zaz）、TTR（PDBID：1f41）、ALB（PDBID：1n5u）进行分子对接计算，并根据对接评分Affinity 对结合力进行评估，其中Affinity ＞ 16.7 kJ/mol提示结合力极弱或认为无结合； 29.302 kJ/mol ＜Affinity≤ 16.7 kJ/mol 提示结合力中等；Affinity≤29.3 kJ/mol 提示结合力较强。对接结果显示小分子配体和受体蛋白共36 种组合（图7），Affinity 值均＜16.7 kJ/mol，最大值为 23.0 kJ/mol，表明核心成分与受体蛋白有着较好的结合力。其中wilforlideA与AKR1B1结合力最强（Affinity = 54.8 kJ/mol），具体对接模式见图8。如图所示，wilforlide A 与AKR1B1 氨基酸残基通过范德华力相互作用，此外与AKR1B1 氨基酸残基LEU195、LYS194 均形成alkyl 相互作用。其余结合力较强的还有triptobenzene H 和AKR1B1、Celastrol和MAPK14 等。

图7 分子对接结果Fig.7 Molecular docking result

图8 Wilforlide A 与AKR1B1 对接模式Fig.8 Wilforlide A and AKR1B1 docking mode

3 讨论

IgAN 是临床常见的原发性肾小球疾病，根据临床表现归属于中医“尿血”、“尿浊”和“肾风”等范畴。现代医学研究显示IgAN 的发病乃多重因素相互作用的结果，患者在遗传易感基因存在的背景下，机体IgA1分子糖基化异常、IgA 清除水平下降，导致pIgA1 及IgA1-免疫复合物（IgA1-IC）形成并沉积于肾小球系膜区，激活补体系统、引发炎症反应及纤维化形成。研究显示[9]火把花根具有明显的免疫抑制及抗炎作用，临床被广泛用于包括IgAN在内的多种肾小球疾病治疗。

本研究最终共筛选出19 个火把花根潜在活性成分，预测到285 个药物靶点及937 个IgAN 疾病靶点，共获得54 个火把花根干预IgAN 潜在靶点。通过成分-靶点网络图的构建与分析，初步预测“雷公藤内酯甲”、“雷公藤春碱”、“雷公藤内酯乙”、“雷公藤红素”等为火把花根干预IgAN 的核心成分；CDK2、AKR1B1、F2 等为核心靶点；Proteoglycans in cancer信号通路、Lipid and atherosclerosis 信号通路、FoxO 信号通路等为主要富集通路。

3.1 潜在有效成分分析

IgAN 患者机体IgA-IC 形成后沉积于肾小球系膜区，刺激系膜细胞表型转化为炎症细胞和纤维化细胞，引起炎症介质的释放，造成肾小球损伤及间质纤维化。研究发现NLRP3 炎症小体的激活及IL-1、IL-18炎症因子的释放与IgAN 发病密切相关[32]。雷公藤红素能够抑制活性氧生成、促使NF- B 活化上调，进而抑制NLRP3 的表达和IL-1 、IL-18 的释放发挥抗炎作用[33]。初始CD4+T 细胞分化形成辅助性T 细胞17（Th17）和调节性T 细胞（Treg），二者发挥相反的作用协同维持机体免疫稳态[34]。IgAN 患者体内Th17/Treg稳态破坏，机体Treg水平降低、Th17 比例及Th17/Treg水平升高[35]。研究显示雷公藤红素可以抑制Th17 细胞水平、促使Treg细胞生成进而发挥免疫抑制作用[36]。

通过网络分析初步筛选的活性成分尚有“雷公藤内酯甲”、“雷公藤内酯乙”和“雷公藤春碱”等。研究显示[37]雷公藤内酯甲对角叉菜胶致炎模型抗炎作用明显；细胞试验表明雷公藤内酯甲可以直接抑制T、B 淋巴细胞增殖、发挥免疫抑制作用[38]。雷公藤春碱亦具有强烈的免疫抑制活性，WU 等[39]研究显示其能明显抑制脂多糖刺激的小鼠单核巨噬细胞增殖。雷公藤内酯乙的药理作用研究较少，文献报道，雷公藤内酯乙能够阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用[40]。但目前尚缺乏以上成分作用于IgAN 的机制研究，未来可将其作为火把花根干预IgAN 的潜在方向深入研究。

3.2 潜在靶点分析

细胞周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）作为周期蛋白依赖性激酶（CDKs）的一种，广泛表达于真核生物中，通过与周期蛋白（Cyclin）结合共同参与细胞周期的调控。系膜细胞增殖与基质增多是IgAN 最基本的病变。既往研究表明肾小球系膜细胞的增殖由多种正负性细胞周期调节蛋白控制，CyclinA-CDK2 的表达和活性增强可以促使系膜细胞增殖[41]；大鼠试验显示雷帕霉素可以通过抑制CyclinE-CDK2 的活性，阻断细胞周期、抑制系膜增殖及基质分泌[42]。

AKR1B1 是糖代谢多元醇途径的关键限速酶，与糖尿病肾病的发生密切相关[43]。当机体处于高血糖状态时，AKR1B1 活性增强，激活多元醇途径，葡萄糖还原生成山梨糖醇积聚于细胞内，引起细胞渗透性损伤；同时该通路激活后机体产生大量自由基、晚期糖基化终末产物，抗氧化剂水平下降，引起肾组织氧化应激损伤[44]，而氧化应激是IgAN 进展的主要危险因素之一[45]。此外，糖代谢异常在IgAN 患者中十分常见[46]，多数糖尿病患者的肾脏损伤可表现为IgAN[47]，但AKR1B1 在IgAN 发病中的具体机制有待进一步明确。

研究表明IgAN患者存在凝血、纤溶系统的异常[48]，血液呈高凝状态[49]。肾小球毛细血管壁与循环中IgA1接触，造成血管壁受损、引起凝血级联反应[50]，凝血反应进一步造成肾间质纤维化[51]、肾小球硬化[52]。凝血酶原（F2）是凝血级联反应的重要节点，被凝血活酶激活生成凝血酶，活化的凝血酶将纤维蛋白原转化为纤维蛋白、刺激血小板聚集和催化一系列凝血相关反应。临床研究[53]显示促纤溶治疗对IgAN 患者有着独立于激素之外的肾脏保护作用。

3.3 KEGG富集信息分析

KEGG 分析显示，交集靶基因富集最明显的通路是Proteoglycans in cancer 信号通路、Lipid and atherosclerosis 信号通路、FoxO 信号通路。Proteoglycans in cancer 通路中的饰胶蛋白聚糖可以抑制TGF- 1 的表达。而TGF- /Smads 信号通路与IgAN 系膜细胞的增殖及肾小球纤维化的发生密切相关。体外试验证实IgA1 及血浆凝溶胶蛋白可以刺激系膜细胞中TGF- 1的分泌及下游Smad3、磷酸化Smad2/3、Smad4 的表达，激活TGF- /Smads 信号通路、诱导IgAN 肾纤维化的发生[54]。

多项研究提示IgAN 患者存在血脂异常的临床表现，患者甘油三酯、总胆固醇显著上升[55]，且合并血脂异常的患者肾脏病理及肾功能损害更为严重[56]。靶向Lipid and atherosclerosis 通路的基因可能通过PI3K/AKT 及VEGF 信号通路影响eNOS 的表达及NO 的释放、参与细胞凋亡生物过程。研究显示[57]IgAN 的发生与肾小球系膜细胞增殖过度或凋亡不足密切相关。由此推测火把花根可能通过eNOS/NO 通路影响肾小球细胞凋亡发挥肾脏保护作用。

叉头框转录蛋白O（FoxO）是转录因子叉头框蛋白（FOX proteins）家族的亚家族，广泛参与细胞代谢、氧化应激、免疫调节和细胞凋亡等生物进程。其中FoxO1 广泛表达于多种细胞中，研究表明其在足细胞凋亡、肾纤维化中扮演重要角色。刘昆等[58]通过细胞实验发现在同型半胱氨酸诱导足细胞凋亡中，FoxO1蛋白表达水平下降，提示FoxO1 在保护足细胞凋亡发挥重要作用；此外，FoxO1 可以通过参与PI3K/Akt、Wnt/ -Catenin 等多条信号通路，调控细胞凋亡、氧化应激、炎症反应等生物过程，抑制肾纤维化的发生[59]。

综上，火把花根通过多成分、多靶点、多途径发挥抗炎、免疫抑制等作用，通过抑制系膜细胞增生、肾小球硬化、间质纤维化等病理进程干预IgAN 的发生。本研究基于现有数据库及网络药理学对火把花根干预IgAN 的分子机制进行了预测，预测结果为进一步动物、细胞基础研究提供了新方向。