紫皮石斛花总黄酮提取工艺优化及抗氧化活性研究

董寿堂，任 远，张旭强，王怀斌，鲁 静，胡 燕

（保山中医药高等专科学校，云南 保山 678000）

紫皮石斛为兰科石斛属植物齿瓣石斛（Dendrobium devoninum Paxt.），又名紫草、香棍草、紫皮兰、水打棒、中黄草、旱马棒等，其性微寒、味甘，归胃、肾经，具有养胃生津、滋阴除热之功效[1-2]，主要分布在我国的云南、贵州、广西及西藏等，其中在云南龙陵有大量的人工种植，且品质好，故该县于2011 年11 月被中国中药协会授予“中国紫皮石斛之乡”称号，2012 年获得了国家工商行政管理总局颁发的《地理标志证明商标注册》证书。研究发现，紫皮石斛茎中含有氨基酸、多糖、酰胺类、苯丙素类、联苄类、二氢菲类、酚酸类、二氢黄酮类、甾醇类及木脂素类等多种化学物质[3-6]，具有抗疲劳[7]、增强免疫[8]、抗氧化[9]及抗菌[10]等作用，且长期食用无明显副作用[11]，未见胚胎毒性及致畸毒性[12]、遗传毒性[13]，属于无毒级物质[3，13]。由于对紫皮石斛花研究较少，而限制了其开发利用。紫皮石斛花在民间人们常常用来泡水、泡酒、榨汁、煮粥及煲汤等食用，认为其具有滋阴润肺、美容养颜、安神解郁及养胃生津的功效，受到越来越多人的喜爱。现代研究发现，紫皮石斛花中含有多糖、多酚、多种氨基酸、粗蛋白质、类黄酮、多种矿物质及挥发性成分等[14-15]，并证实了紫皮石斛花乙醇提取物、多糖及氨基酸具有较好的体外抗氧化作用[16-17]。但紫皮石斛花总黄酮提取工艺及功效的研究鲜见报道。黄酮类化合物普遍存在于各种植物中，具有抗氧化、抗炎、抗衰老、抗肿瘤和调节免疫等作用[18]，有着广泛的开发应用前景。因此，通过对紫皮石斛花总黄酮提取工艺及作用的研究，可为保健品、药品的开发奠定基础，从而提高紫皮石斛花开发应用价值。

以紫皮石斛花为原料，采用超声波法提取总黄酮，在单因素试验基础上，通过响应面法优化紫皮石斛花总黄酮提取工艺条件，并探讨紫皮石斛花总黄酮对超氧阴离子、DPPH 自由基及羟自由基的清除作用，为紫皮石斛花下一步的研究开发提供参考。

1 试验部分

1.1 主要仪器与试剂

YF-150 型高速中药粉碎机，浙江省瑞安市永历制药机械有限公司产品；SQP 型电子天平，赛多利斯科学仪器（北京） 有限公司产品；1524 型台式普通离心机，丹麦Labogene 公司产品；SHA-2 型冷冻水浴恒温振荡器，金坛市盛威实验仪器厂产品；SB-800DTD 型超声清洗仪，宁波新艺超声设备有限公司产品；UV-1800 型紫外可见分光光度计，上海美普达仪器有限公司产品；Elx808 型酶标仪，美国佰腾仪器有限公司产品。

紫皮石斛花，云南省保山市龙陵天和土特产商贸发展有限公司提供；L- 抗坏血酸（分析纯），上海易恩化学技术有限公司提供；总黄酮试剂盒、超氧阴离子清除能力试剂盒、羟自由基清除能力试剂盒、DPPH 自由基清除能力试剂盒，苏州格锐思生物科技有限公司提供；无水甲醇、无水乙醇（分析纯），天津市风船化学试剂科技有限公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 总黄酮提取

取干燥紫皮石斛花适量，于60 ℃下烘干至恒质量，粉碎、过60 目筛。称取紫皮石斛花粉末0.03 g，按一定料液比加入一定体积分数的乙醇，浸泡12 h，于一定温度，800 W 超声波下提取一定的时间，以转速12 000 r/min 离心10 min，取上清液，用60%乙醇定容至1.5 mL，备用。

1.2.2 总黄酮含量测定

按照“总黄酮试剂盒说明书”操作方法，采用酶标仪于波长510 nm 处测定吸光度。根据说明书中回归方程Y=1.627 7X-0.004 9（R2=0.999 9），计算紫皮石斛花总黄酮质量浓度，依据公式（1） 得出总黄酮提取率。

式中：C——回归方程中得出的紫皮石斛花总黄酮质量浓度，mg/mL；

V——提取液定容后体积，mL；

W——样品质量，g。

1.2.3 单因素试验

（1） 乙醇体积分数对紫皮石斛花总黄酮提取率的影响。称取0.03 g 紫皮石斛花粉末，以料液比1∶50（g∶mL），分别加40%，50%，60%，70%，80%乙醇，在温度60 ℃下以800 W 功率超声提取30 min，考查不同乙醇体积分数对紫皮石斛花总黄酮提取率的影响。

（2） 料液比对紫皮石斛花总黄酮提取率的影响。称取0.03 g 紫皮石斛花粉末，分别以料液比为1∶30，1∶35，1∶40，1∶45，1∶50（g∶mL） 加入60%乙醇，于60 ℃的温度下以800 W 功率超声提取30 min，考查不同料液比对紫皮石斛花总黄酮提取率的影响。

（3） 提取温度对紫皮石斛花总黄酮提取率的影响。称取0.03 g 紫皮石斛花粉末，以料液比1∶50（g∶mL） 加60%乙醇，并分别于40，50，60，70，80 ℃的温度下以800 W 功率超声提取30 min，考查不同提取温度对紫皮石斛花总黄酮提取率的影响。

（4） 提取时间对紫皮石斛花总黄酮提取率的影响。称取0.03 g 紫皮石斛花粉末，以料液比1∶50（g∶mL） 加入60%乙醇，并在温度60 ℃下以800 W功率超声分别提取20，25，30，35，40 min，考查不同提取时间对紫皮石斛花总黄酮提取率的影响。

1.3 响应面试验设计

根据单因素试验结果，分别确定乙醇体积分数（A）、液料比（B）、提取温度（C） 及提取时间（D）四因素的3 个水平。利用Design Expert 8.0.6 软件中Box-behnken 方法设计优化试验方案，以紫皮石斛花总黄酮提取率（Y） 为响应值，确定紫皮石斛花总黄酮提取的最佳工艺。

Box-behnken 试验设计因素与水平设计见表1。

表1 Box-behnken 试验设计因素与水平设计

1.4 体外抗氧化试验

1.4.1 溶液制备

（1） 紫皮石斛花总黄酮溶液的配制。称取1.20 g紫皮石斛花粉末，按照最佳提取工艺条件进行提取，并根据2.3.2 中方法测定其含量，然后用蒸馏水将其配制成0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 mg/mL溶液，4 ℃下保存备用。

（2） L- 抗坏血酸溶液的配制。称取L- 抗坏血酸100 mg，用适量的蒸馏水溶解，并定容至100 mL，再用蒸馏水配制成0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 mg/mL 溶液，4 ℃下保存备用。

1.4.2 清除超氧阴离子能力的测定

按照“超氧阴离子清除能力试剂盒说明书”操作方法，分别测定不同浓度紫皮石斛花总黄酮溶液及L - 抗坏血酸溶液的吸光度，并根据说明书中的公式（2） 计算超氧阴离子清除率。

式中：A测定——测定管的吸光度；

A对照——对照管的吸光度；

A空白——空白管的吸光度。

1.4.3 清除DPPH 自由基能力的测定

按照“1,1 - 二苯基- 2 - 三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 自由基清除能力试剂盒说明书”操作方法，分别测定不同浓度紫皮石斛花总黄酮溶液及L - 抗坏血酸溶液的吸光度，并根据说明书中的公式（3） 计算DPPH 自由基清除率。

式中：A测定——测定管的吸光度；

A对照——对照管的吸光度；

A空白——空白管的吸光度。

1.4.4 清除羟自由基能力的测定

按照“羟自由基清除能力试剂盒说明书”操作方法，分别测定不同浓度紫皮石斛花总黄酮溶液及L- 抗坏血酸溶液的吸光度，并根据说明书中的公式

（4） 计算羟自由基清除率。

式中：A测定——测定管的吸光度；

A对照——对照管的吸光度；

A空白——空白管的吸光度。

1.5 统计方法

所有试验数据均为平行测定3 次所得，用均数±标准差表示，利用Excel、Design Expert 8.0.6、Sigma Plot 10.0 软件进行数据统计分析及绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇体积分数对紫皮石斛花总黄酮提取率的影响

乙醇体积分数对紫皮石斛花总黄酮提取率的影响见图1。

图1 乙醇体积分数对紫皮石斛花总黄酮提取率的影响

由图1 可知，随着乙醇体积分数增加，紫皮石斛花总黄酮提取率先增加后降低，当乙醇体积分数达到60%时，总黄酮提取率最大。而乙醇体积分数超过60%后，总黄酮提取率反而下降，其可能是乙醇体积分数增加，降低了总黄酮类溶解性，并增加了其他醇溶性杂质溶出，导致总黄酮提取率降低[19]。因此，选择50%～70%乙醇优化提取工艺。

2.1.2 料液比对紫皮石斛花总黄酮提取率的影响

料液比对紫皮石斛花总黄酮提取率的影响见图2。

图2 料液比对紫皮石斛花总黄酮提取率的影响

由图2 可知，随着料液比增加，总黄酮提取率呈现先增后降趋势。当料液比达到1∶35（g∶mL）时，总黄酮提取率为最高，而料液比超过1∶35（g∶mL） 后，总黄酮提取率逐渐降低，可能是料液比的提高，增加了其他杂质溶出，从而降低了总黄酮提取率[19]。因此，选择1∶35～1∶45（g∶mL） 料液比优化提取工艺。

2.1.3 提取温度对紫皮石斛花黄酮提取率的影响

提取温度对紫皮石斛花总黄酮提取率的影响见图3。

图3 提取温度对紫皮石斛花总黄酮提取率的影响

由图3 可知，随温度增加，总黄酮提取率先增后降，当温度为70 ℃时，提取率最高，而温度超过70 ℃，提取率有所下降，其可能是由于温度的提高，破坏了部分黄酮，导致总黄酮提取率降低[19]。因此，选择60～80 ℃提取温度优化提取工艺。

2.1.4 提取时间对紫皮石斛花总黄酮提取率的影响

提取时间对紫皮石斛花总黄酮提取率的影响见图4。

图4 提取时间对紫皮石斛花总黄酮提取率的影响

由图4 可知，随着提取时间的延长，总黄酮提取率先增加后降低，当提取时间为25 min 时，提取率达到最大值，而提取时间超过25 min，总黄酮提取率不断降低，其可能是提取时间延长，导致部分黄酮被破坏[19]。因此，选择20～30 min 提取时间优化提取工艺。

2.2 响应面试验结果及分析

2.2.1 响应面试验结果

以A、B、C、D 4 个因素为自变量，响应值为Y，利用Box-behnken 试验原理设计响应面试验。

Box-behnken 响应面试验及结果见表2。

表2 Box-behnken 响应面试验及结果

2.2.2 回归模型方差分析

采用Design Expert 8.0.6 软件对表2 中试验数据进行多元回归分析，得到紫皮石斛花总黄酮提取率对自变量的二元多项回归方程为：

Y=2.56-0.24A-0.047B+0.100C+0.033D-0.023AB+0.045AC-0.020AD-0.025BC-0.068BD+0.030CD-0.028A2+0.24B2+0.13D2+0.11D2。

回归模型的方差分析见表3。

表3 回归模型的方差分析

由表3 可知，回归模型具有显著性（p＜0.05），失拟项不显著（p＞0.05），模型回归方程的相关系数R2=0.723 5，说明该模型回归方程拟合度好，具有较好的准确性及可信度。A、B2具有极显著性（p＜0.01），提示乙醇体积分数及二次项料液比对紫皮石斛花总黄酮提取率影响极显著。由表中F 值可知，影响紫皮石斛花总黄酮提取率的因素顺序为A＞C＞B＞D。

2.2.3 响应面分析与优化

乙醇体积分数与料液比对总黄酮提取率影响的响应面及等高线图见图5，乙醇体积分数与提取温度对总黄酮提取率影响的响应面及等高线图见图6，乙醇体积分数与提取时间对总黄酮提取率影响的响应面及等高线图见图7，料液比与提取温度对总黄酮提取率影响的响应面及等高线图见图8，料液比与提取时间对总黄酮提取率影响的响应面及等高线图见图9，提取温度与提取时间对总黄酮提取率影响的响应面及等高线图见图10。

图5 乙醇体积分数与料液比对总黄酮提取率影响的响应面及等高线图

图6 乙醇体积分数与提取温度对总黄酮提取率影响的响应面及等高线图

图7 乙醇体积分数与提取时间对总黄酮提取率影响的响应面及等高线图

图8 料液比与提取温度对总黄酮提取率影响的响应面及等高线图

图9 料液比与提取时间对总黄酮提取率影响的响应面及等高线图

图10 提取温度与提取时间对总黄酮提取率影响的响应面及等高线图

响应面分析图中响应面坡度、等高线密集度及形状可反映两因素交互作用是否显著。响应面坡度越大，等高线越密集并呈椭圆形，说明两因素交互作用显著；反之，响应面坡度越小，等高线越稀疏并呈圆形，说明两因素交互作用不显著[27-30]。因此，由图5 ～图10 可知，各图的响应面坡度小，等高线不密集并呈椭圆形，提示AB、AC、AD、BC、BD及CD 因素交互作用不显著。

2.2.4 最佳提取工艺预测及验证

通过二元多项回归方程可预测得到紫皮石斛花总黄酮最佳提取工艺为乙醇体积分数60.17%，料液比1∶35.14（g∶mL），提取温度69.97 ℃，提取时间29.00 min，在此条件下总黄酮提取率可达3.41%，为了试验的可操作性，将以上的最佳工艺修正为乙醇体积分数60%，料液比1∶35（g∶mL），提取温度70 ℃，提取时间29 min，在该条件下平行重复3 次试验，得到总黄酮提取率为3.54%±0.013%，接近于预测值，说明二元多项回归方程模型拟合度较好，可用于紫皮石斛花总黄酮的提取。

2.3 体外抗氧化试验结果

2.3.1 紫皮石斛花总黄酮对超氧阴离子的清除作用

紫皮石斛花总黄酮对超氧阴离子的清除作用见图11。

图11 紫皮石斛花总黄酮对超氧阴离子的清除作用

由图11 可知，在质量浓度0～0.8 mg/mL 范围内，紫皮石斛花总黄酮、L- 抗坏血酸对超氧阴离子清除率存在量效关系，清除率随着质量浓度的增加而提高，当质量浓度达到0.8 mg/mL 时，清除率达到最大，分别为61.41%，86.80%，对超氧阴离子的半数抑制质量浓度（Half inhibitory concentration，IC50） 分别为0.32，0.08 mg/mL，说明紫皮石斛花总黄酮具有较好的清除超氧阴离子能力，但要比L - 抗坏血酸的清除能力弱。

2.3.2 紫皮石斛花总黄酮对DPPH 自由基的清除作用

紫皮石斛花总黄酮对DPPH 自由基的清除作用见图12。

图12 紫皮石斛花总黄酮对DPPH 自由基的清除作用

由图12 可知，在质量浓度0～0.8 mg/mL 范围内，紫皮石斛花总黄酮、L- 抗坏血酸对DPPH 自由基清除率存在量效关系，清除率随着质量浓度的增加而提高，当质量浓度达到0.8 mg/mL 时，清除率达到最大，分别为86.70%，89.28%，对DPPH 自由基的IC50分别为0.17，0.003 mg/mL，说明紫皮石斛花总黄酮具有较强的清除DPPH 自由基能力，但不及L - 抗坏血酸。

2.3.3 紫皮石斛花总黄酮对羟自由基的清除作用

紫皮石斛花总黄酮对羟自由基的清除作用见图13。

图13 紫皮石斛花总黄酮对羟自由基的清除作用

由图13 可知，在质量浓度0～0.8 mg/mL 范围内，紫皮石斛花总黄酮、L- 抗坏血酸对羟自由基清除率存在量效关系，清除率随着质量浓度的增加而提高，当质量浓度达到0.8 mg/mL 时，清除率达到最大，分别为31.50%，86.39%，对羟自由基清除率的IC50分别为0.42，0.18 mg/mL，说明紫皮石斛花总黄酮具有一定的清除羟自由基能力，但比L - 抗坏血酸的清除能力弱。

3 结论

在单因素试验分析乙醇体积分数、料液比、提取温度及提取时间对紫皮石斛花总黄酮提取率影响的基础上，利用响应面试验方法对紫皮石斛花总黄酮提取工艺进行优化，得到最佳提取工艺条件为乙醇体积分数60%，料液比1∶35（g∶mL），提取温度70 ℃，提取时间29 min，在此条件下，紫皮石斛花总黄酮平均提取率为3.54%，与预测值3.41%接近，提示该提取工艺可用于紫皮石斛花总黄酮的提取。通过体外抗氧化试验结果显示，在0～0.8 mg/mL质量浓度范围内，紫皮石斛花总黄酮的抗氧化作用存在量效关系，其对超氧阴离子、DPPH 自由基、羟自由基最大清除率分别为61.41%，86.70%，31.50%，IC50分别为0.32，0.17，0.42 mg/mL，说明紫皮石斛花总黄酮具有较好的抗氧化作用。该研究可为紫皮石斛花总黄酮的提取及其相关保健品、药品等方面的研究开发提供参考。