三种结核潜伏感染试验在HIV感染人群中的应用评价

周崇兴 梁大斌 黄彦 崔哲哲 覃慧芳 黄莉雯 区进 叶婧

[摘要] 目的 評价AIMTB和T-SPOT检测方法在人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染人群中结核潜伏感染的诊断效能。方法 收集2022年9～10月在广西壮族自治区疾病预防控制中心门诊就诊的HIV感染者的血样标本，使用雷德AIMTB、迪奥T-SPOT和凯杰QFT三种方法进行检测，以QFT作为参照对检测结果进行诊断效能评价。结果 AIMTB方法检出阳性率为54.6%，敏感度、特异性分别为84.72%、76.19%；T-SPOT方法检出阳性率为57.6%，敏感度和特异性分别为88.89%、73.02%。AIMTB方法和T-SPOT方法与QFT方法比较结果具有一致性（P<0.001）。结论 AIMTB方法和T-SPOT方法均具有较高的阳性检出率，与QFT方法的一致性较好，可加大样本量进一步验证及推广。

[关键词] 结核；γ干扰素释放试验；结核潜伏感染

[中图分类号] R446.5      [文献标识码] A      [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2023.16.006

Evaluation of three latent tuberculosis infection tests in HIV-infected population

ZHOU Chongxing， LIANG Dabin， HUANG Yan， CUI Zhezhe， QIN Huifang， HUANG Liwen， Ou Jin， YE Jing

Guangxi Zhuang Autonomous Region Center for Disease Control and Prevention， Guangxi Key Laboratory of Major Infectious Disease Prevention and Control and Biosafety Emergency Response， Nanning 530028， Guangxi， China

[Abstract] Objective To evaluate the effectiveness of AIMTB and T-SPOT tests in the diagnosis of latent tuberculosis infection in human immunodeficiency virus （HIV） infected population. Methods Collect blood samples from HIV-infected patients in the outpatient department of Guangxi Zhuang Autonomous Region Center for Disease Control and Prevention from September to October 2022. The blood samples were tested by three methods： AIMTB， T-SPOT and QFT test. The test results were evaluated by diagnostic tests with QFT as a reference. Results The positive rate of AIMTB was 54.6%， the sensitivity and specificity were 84.72% and 76.19%， respectively. The positive rate of T-SPOT was 57.6%， the sensitivity and specificity were 88.89% and 73.02%， respectively. AIMTB and T-SPOT were consistent with QFT test （P<0.001）. Conclusion AIMTB and T-SPOT have high positive detection rates， and they are consistent with QFT test， which can be further verified and popularized by increasing the samples.

[Key words] Tuberculosis; Interferon-γ release assay; Latent tuberculosis infection

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的呼吸道传染性疾病，是一种主要致死性传染病，可对人体健康构成严重威胁。据2019年世界卫生组织估算，全球约有17亿人感染结核分枝杆菌，这些感染者以隐性感染为主[1]。中国是全球结核病负担最重的国家之一[2]。结核潜伏感染者可长期没有临床症状，但5%～10%的感染者有发展为活动性肺结核的风险，如果同时伴有人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染，这种风险还会增加[3-4]。因而，筛查结核潜伏感染者并进行积极有效的干预或治疗，能从源头上找出结核病潜在的传染源并阻止传播，极大地促进结核病防控，保护人类健康。目前尚无金标准对结核潜伏感染进行诊断，传统方法主要使用结核菌素皮肤试验，该方法受到既往感染或卡介苗等影响，实际应用中有一定的局限性。本研究使用γ干扰素释放试验，选取雷德AIMTB、迪奥T-SPOT和凯杰QFT三种检测试剂盒，对139份纳入人群的血样标本进行检测，探讨雷德AIMTB和迪奥T-SPOT检测方法在结核潜伏感染中的诊断效能。

1  资料与方法

1.1  研究对象

选取2022年9～10月在广西壮族自治区疾病预防控制中心门诊就诊的HIV感染者为研究对象，在获得其知情同意后，问询既往是否做过结核菌素皮试，既往皮试阳性者纳入本研究，既往没做过皮试或皮试阴性者给予排除，最终共纳入139名研究对象。本研究经广西伦理审查委员会批准开展（伦理审批号：GXIRB2019-0017）。

1.2  方法

对139名符合纳入标准的研究对象使用含肝素锂抗凝剂采样管采集静脉血标本12ml。

1.2.1  主要仪器和试剂  酶标仪（赛默飞）；二氧化碳培养箱（赛默飞）；AIMTB试剂盒（雷德）；T-SPOT试剂盒（迪奥）；QFT试剂盒（凯杰），试剂均在有效期内使用。

1.2.2  AIMTB检测  标本采集混匀后分别取0.6ml抗凝血分装至三根细胞刺激培养管（N、T、P），37℃培养管直立孵育18～22h，1000g离心5min，收集血浆，加入至AIMTB酶联免疫吸附试验微孔板，按照试剂说明书进行酶联免疫吸附试验操作和结果判读。

1.2.3  T-SPOT检测  标本按以下步骤分离外周血单个核细胞：将等体积RPMI-1640培养液与血标本混匀，缓慢移入含有4ml分离液的离心管，1000g离心22min，取云雾层细胞富集液至含6ml培养液离心管，600g离心7min，弃上清，10ml培养液重悬细胞，350g离心7min，弃上清，加入500μl的培养基，混匀细胞后进行计数，将每个标本的淋巴细胞稀释至2.5×106个/ml。每个标本设4个检测孔，分别加入50μl阴性对照、抗原A、抗原B、阳性对照和100μl稀释后的细胞液，CO2培养箱（37℃，5% CO2）培养16～20h，培养后按试剂说明书进行染色和结果判读。

1.2.4  QFT检测  标本采集混匀后分别取1ml抗凝血分装至三根细胞刺激培养管（N、T、M），37℃孵育16～24h，3000g离心15min，收集血浆，加入到QFT-GIT酶联免疫吸附试验微孔板，按照试剂说明书进行酶联免疫吸附试验操作和结果判读。

1.3  统计学方法

采用SPSS 23.0软件进行数据处理和统计分析。计数资料以例数（百分率）[n（%）]表示，使用Kappa检验进行不同试剂间的一致性比较，对三种试剂的敏感度、特异性、阳性预测值、阴性预测值进行评估，阳性率的比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  三种结核分枝杆菌检测方法的检测阳性率

139份标本，AIMTB方法检出阳性率为54.6%（76/139），不确定2例；T-SPOT方法检出阳性率为57.6%（80/139），不确定3例；QFT方法检测阳性率为51.8%（72/139），不确定4例。AIMTB和T-SPOT两种方法检出阳性率均高于QFT方法（c2=56.11，102.03，P<0.001），见表1。

2.2  一致性检验

本研究以QFT方法作为标准，AIMTB方法和T-SPOT方法与QFT方法比较结果具有一致性（P<0.001），见表1。

2.3  敏感度和特异性检验

AIMTB方法的敏感度和特异性分别为84.72%、76.19%，阳性预测值和阴性预测值分别为80.26%、78.69%，约登指数为0.61；T-SPOT方法的敏感度和特异性分别为88.89%、73.02%，阳性预测值和阴性预测值分别为80.00%、82.14%，约登指数为0.62。

3  討论

肺结核是慢性传染病，由结核分枝杆菌感染所致，是致死率位居第二的传染病，也是HIV感染者和抗生素耐药相关死亡的主要原因。据估算，2021年全球新发结核病患者1060万例，HIV感染者占6.7%[5]。我国是肺结核负担较高的国家之一，结核病防控面临巨大的压力和挑战，特别是结核潜伏感染人群，基数大且没有临床症状，5%～10%可发展为活动性结核病患者，如果伴有HIV感染，这个数据还会增加。实验室检测是发现结核病患者的主要技术手段，目前常用于结核病诊断的检测技术主要有涂片镜检、痰培养及分子生物学等。涂片镜检受样本质量、涂片技术及阅片经验的影响，检出率相对较低，易发生漏诊，导致患者未得到及时治疗；痰培养同样受样本质量的影响，只能诊断活动性肺结核且耗时长，影响结核病早期诊断，延误治疗；分子生物学作为结核分枝杆菌快速试验，极大缩短检测时间，可辅助临床诊断，但需获得带菌标本，无法检测结核潜伏感染者，同时需要配套的设备和试剂价格昂贵。基于常用检测技术存在的不足，寻找新的结核病诊断方法及早期快速准确地发现结核病患者对结核病防控意义重大[6]。γ干扰素释放试验的原理是人体感染结核分枝杆菌后，致敏T淋巴细胞存在于体内，当机体再次接触结核分枝杆菌相应抗原时，体内致敏T淋巴细胞迅速活化为效应T淋巴细胞，释放出高水平的γ干扰素，γ干扰素的释放程度可作为一项评估受试对象是否受到结核分枝杆菌感染的指标[7]。尽管γ干扰素释放试验也有很多不足，如阳性结果需要结合流行病学资料、影像学资料和其他医疗及诊断结果共同评估，才能得出正确的诊断结果；不能区分是近期获得的感染还是既往感染的延续；不能区分潜伏性感染还是活动性结核，但并不妨碍该方法作为结核潜伏感染的体外诊断技术逐步推广，其独特的技术优势能更好地辅助结核病防控，深受各国青睐。QFT检测于2001年在美国获得许可，开始作为结核病感染的体外辅助诊断技术，是全球最早用于辅助诊断结核分枝杆菌感染的γ干扰素释放试验，也是目前世界卫生组织推荐用于结核潜伏感染的诊断方法[8]。艾滋病群体由于免疫力低下，在接受抗病毒治疗后结核潜伏感染往往被低估；但在中国西安开展的HIV阳性人群QFT检测研究中发现，其阳性率高于传统检测方法，γ干扰素释放试验更适合在免疫力低下的合并HIV感染人群中开展结核分枝杆菌潜伏感染检测[9]。

雷德AIMTB是近几年上市的用于γ干扰素释放试验的国产试剂，该试剂选择在卡介苗和大多数非结核普遍缺失的早期分泌抗原6（early secretory anti-gen-6，ESAT-6）和培养滤液蛋白10（culture filtrate protein 10，CFP-10），通过基因工程技术修饰后表达成为刺激抗原，与新鲜采集的抗凝全血混合孵育后，用酶联免疫吸附试验检测特异性释放的γ干扰素水平，进而判定检测结果。本研究显示AIMTB方法检测的阳性率为54.6%，略高于QFT的51.8%。AIMTB采用三联管和标签设计，能够适应大批量样本检测需求，QFT的刺激管需多管标记，抗原混匀步骤相对烦琐，两者都使用酶联免疫吸附试验技术进行后期操作和结果判读；AIMTB操作步骤相对QFT更简化，所需样本量更少，具有一定的优势。T-SPOT试剂使用酶联免疫斑点技术检测经结核特异性抗原ESAT-6、CFP-10肽段库刺激后外周血单个核细胞的γ干扰素释放，经一系列反应后斑点显示判读结果。研究发现T-SPOT是最敏感的检测结核抗原特异性T淋巴细胞的技术之一[10]。本研究结果显示T-SPOT方法检出阳性率为57.6%，高于QFT的51.8%。T-SPOT方法检测结果受患者的性别、年龄和免疫状况等因素影响较小，现广泛应用于临床预防性治疗的辅助诊断[11-12]。Talati等[13]研究显示，在HIV感染群体中，CD4细胞数的多少与QFT阳性率相关，但与T-SPOT的阳性率无关，这也很好地解释本研究T-SPOT的阳性率高于QFT的原因。相对于QFT方法使用三种蛋白（ESAT-6、CFP-10、TB7.7）的混合多肽刺激肝素化全血中的致敏T淋巴细胞，T-SPOT方法在成本和抗干扰因素方面有一定的优势，但其通过分离液收集淋巴细胞，且需将淋巴细胞稀释至相应浓度再进行检测、人工计数和分析，操作方法更为烦琐，结果误差相对较大。

以QFT试验作为评价标准分析两种检测方法的一致性，AIMTB检测方法的Kappa值为0.583，具有中等一致性，T-SPOT检测方法的Kappa值为0.625，一致性较高。本研究中T-SPOT方法的敏感度为88.89%，特异性为73.02%，与De Keyser等[14]研究结果基本相符。AIMTB的敏感度略低于T-SPOT，特异性略高于T-SPOT。AIMTB方法和T-SPOT方法的阳性预测值均能达到80%，阴性预测值均高于78%，两种方法的诊断价值较高；两种方法的约登指数分别为0.61和0.62，说明两种方法的检测效果较好，真實性可靠。

本研究的三种γ干扰素释放试验均可用于结核潜伏感染的检测，主要用于辅助诊断结核病感染，可较好地区分非结核分枝杆菌和结核分枝杆菌感染，敏感度和特异性均较高，结果可重复性强，但不能鉴别是否为活动性肺结核[15]。其他分枝杆菌感染（堪萨斯分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、海分枝杆菌等）也可能会导致结果阳性，这也给检测结果的真实性和准确性带来挑战。以世界卫生组织推荐的QFT方法作为评价标准，AIMTB和T-SPOT方法均有较好的一致性和符合率，但由于“金标准”的缺乏，两种方法的敏感度和特异性评价可能存在偏差[16]。本研究纳入的研究对象为HIV感染者，此类人群免疫力相对低下，感染结核病的风险增加，这也是检测结果阳性率较高的原因之一。在国外开展的一项健康人群监测中，γ干扰素释放试验的阳性率为23%，远低于本研究结果[17]。在HIV感染人群中开展γ干扰素释放试验，能够尽早发现双重感染者，从而尽早开展预防性用药或治疗，提高患者的生活质量，减少结核病传播风险，降低结核病病死率。

[参考文献][1] World Health Organization. Global tuberculosis report 2019[R/OL]. （2019-10-15）[2023-05-24]. https：//www. who.int/publications/i/item/9789241565714.

[11] 盧青纯， 唐小燕， 熊恬园， 等. T-SPOT. TB试验在活动性结核诊断中的价值及其影响因素分析[J]. 中国循证医学杂志， 2014， 14（5）： 522–526.