微波对大豆蛋白氧化聚集体结构及功能特性的影响

江连洲 ，王一畅 ，马依彤 ，刘 军 ，杨宗瑞 ，郭增旺 ※

（1. 东北农业大学食品学院,哈尔滨 150030；2. 山东禹王生态食业有限公司,德州 253000；3. 克东禹王大豆蛋白食品有限公司,齐齐哈尔 161000）

0 引言

大豆分离蛋白（soy protein isolate，SPI）是一种由脱脂大豆粕为原料生产的蛋白质质量分数达90%以上的食品原料[1]，因其具有优良的功能性质和生理活性等特点而被广泛应用于食品工业中[2]。目前，中国大豆分离蛋白年生产能力已达70 万t，总产值突破百亿，居世界第一。当储存和运输时间过长时，大豆分离蛋白的氧化改变了理化性质，导致其加工特性劣变，并最终影响其在食品加工品质中的应用[3]。脂质过氧化会产生各种活性氧成分物质（reactive oxygen species，ROS），它们已被证实是导致蛋白质氧化的重要因素[4]。一些研究表明，氧化修饰可引起蛋白质多肽骨架和氨基酸残基侧链的一系列变化，促进二硫键的形成并加强蛋白质的聚集，暴露后分子内的基团重组形成低聚物，在疏水性和静电吸引作用下进一步形成大分子聚集体，导致其溶解性和结构柔性降低，进而使功能性质劣化[5]。且氧化程度越高，蛋白质变性越剧烈，其功能特性的变化越明显。因此，调控蛋白质分子的聚集程度是改善蛋白质氧化聚集体功能活性下降的重要解决方式。

目前，许多研究工作都集中在使用物理方法通过加热、机械作用等改变蛋白质的结构和聚集程度，实现对蛋白质聚集体的调控。文献[6]表明，高压均质使蛋白质解聚从而提高了蚕豆蛋白质的溶解度。文献[7]表明，超声处理通过调控蛋白质聚集度的不同导致其不同的理化和功能特性。但是，由于其巨大功率消耗和较低的生产能力，高压均质化和超声波工艺很难在食品工业中广泛使用[8]。微波作为一种物理加工技术，由于其绿色、高效、简单的操作方式，更适合在食品工业中应用[9]。微波改性的机制主要是因为偶极和离子振动生热，食品物料的带电性和极性基团在微波场下的响应不同，会产生振动，旋转，最终表现为微波的靶向加热，进而改变物料的理化和功能性质。现有研究表明微波处理能提高蛋白的乳化性、起泡性和交联特性等功能特性，同时微波加热的特殊效应还能够改变蛋白的构象。一方面是因为微波交变电场下蛋白质氨基酸残基上的带电基团发生波动，导致蛋白质分子间的电场和静电相互作用重新分布[9]。另一方面蛋白质带电基团在微波场下的特殊响应也会对蛋白质的功能特性产生影响。文献[10]发现微波处理有助于形成紧凑的网络结构，蛋白质结构刚性和柔性区域的位置被改变。文献[11]表明微波诱导了蛋白质极化和非极性基团的暴露，蛋白质柔性区域增加，从而使起泡性得到改善。文献[12]研究表明大米蛋白受到微波处理后其内部的游离巯基减少，生成了新的二硫键，增强了蛋白质凝胶网络的强度，进而改变大米的加工特性。这些研究均表明微波处理工艺能通过改变蛋白的聚集结构和分子构象来改变其功能特性。但是目前，关于微波对氧化聚集体的结构和功能活性作用间的关系，尤其是微波对大豆蛋白氧化聚集体的影响鲜有报道。

偶氮二异丁脒盐酸盐(2,2′-azobis (2-amidinopropane)dihydrochloride，AAPH)是一种具有良好可控性、稳定性、重复性和适用性的自由基引发剂，因其不含腈基，分解产物无毒，同时比其他引发剂分解平稳，安全性高。改变AAPH 的浓度可以调节导致蛋白质氧化的过氧自由基的生成，以模拟蛋白质在长期储存和运输过程中的环境，并获得类似于实际储存和运输的氧化蛋白质模型。因此，本研究以大豆蛋白为研究对象，采用AAPH 构建过氧自由基－大豆蛋白氧化体系，模拟工厂储藏过程中实际产生的蛋白氧化聚集体，将蛋白氧化聚集体分别进行不同时间的微波改性处理，探究微波处理对蛋白结构特性和功能特性的影响，进而研究微波对大豆蛋白氧化聚集体结构的改变与功能特性变化的关系，以期从分子水平解析微波调控大豆蛋白氧化聚集体解聚作用机理，从而为提升大豆蛋白氧化聚集体的功能性质以及大豆蛋白产品的开发和储藏提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆分离蛋白（SPIs 纯度94.2%），山东禹王生态食业有限公司；偶氮二异丁脒盐酸盐 (AAPH) 美国Sigma 公司；十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；非转基因一级大豆油，长春市辽都粮油有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

M1-L213B 型微波炉，美的集团有限公司；pilot10-15EP 型真空干燥机，博医康公司；Zetasizer Nano ZSP型纳米粒度电位仪，马尔文帕纳科技有限公司；Nicolet is50 型傅里叶变换红外光谱仪，赛默飞世尔科技有限公司；F-4 500 型荧光分光光度计，日本HITACHI 公司。

1.3 样品制备

参考 CHENG 等[13]的方法，以10 mg/mL 的质量浓度把大豆分离蛋白溶解于磷酸盐缓冲溶液（0.01 mol/L，pH 值7.2）中。避光条件下加入0.5 mmol/L 的AAPH 后恒温37 ℃水浴处理6 h，然后使用14 000 kDa 透析袋4 ℃透析处理72 h，期间每隔4 h 更换一次去离子水，得到氧化大豆蛋白溶液，经过冷冻干燥后制得大豆蛋白氧化聚集体样品，命名为OSPI。将制得的大豆蛋白氧化聚集体分别在功率为350 W 的条件下进行微波处理0、10、20、30、40、50、60、70 s 微波处理后制得7 种不同的微波处理大豆蛋白氧化聚集体样品，按照微波处理时间的不同分别命名为WOSPI-10、WOSPI-20、WOSPI-30、WOSPI-40、WOSPI-50、WOSPI-60、WOSPI-70。

1.4 粒径分布测定

将样品用去离子水稀释为质量浓度0.05 g/mL 的蛋白溶液，加入测量池中，采用纳米粒度及Zeta 电位分析仪，设定参数为：蛋白质折射率等于1.460、分散剂折射率等于1.330，在(25±2) ℃下测定其粒径分布特征和蛋白质分散指数。

1.5 浊度测定

参考文献[14]的方法,并略加改动。将各组样品采用磷酸盐缓冲溶液配制成所需的蛋白浓度后，磁力搅拌60 min，采用荧光光度计测定600 nm 波长下的吸光度值A，浊度T由式T=1.032×计算获得，式中T为浊度，A为吸光度值，V为稀释倍数，I为光程（0.001 m）。

1.6 硫磺素T（Th T）荧光检验分析

将样品用去离子水配制为10 mg/mL 质量浓度样品溶液。将4 mg 的Th T 溶于250 mL 的pH 值7.2，0.01 mol/L 磷酸盐缓冲溶液（含3 mmol/L 的NaCl），充分溶解后过0.22 μm 滤膜除去不溶物质，制得Th T 溶液。将50 μL的样品溶液和5 mL 的Th T 溶液充分混匀后以Th T 溶液为对照，于440 nm 激发波长，482 nm 发射波长测定其荧光强度，狭缝宽度均为5 nm[15-16]。

1.7 傅里叶红外扫描光谱分析

称取2 mg 样品与200 mg 溴化钾研磨混匀压片测定傅里叶红外扫描光谱，测定温度为25 ℃，设定参数如下：扫描波数为4 000～400 cm-1，波数精度为0.5 cm-1，分辨率为4 cm-1，扫描32 次。所得数据经Peak Fit 软件对酰胺Ⅰ带1 750～1 550 cm-1波段进行分析[17]。

1.8 内源性荧光光谱分析

使用RF-7 000 PC 荧光分光光度计测定样品的荧光光谱，将样品以1 mg/mL 的浓度溶于去离子水中得到样品溶液，在激发波长290 nm、发射波长在300～400 nm、夹缝宽均为5.0 nm 的条件下测定样品的内源性荧光光谱[18]。

1.9 溶解度测定

将样品以1 mg/mL 的浓度溶于去离子水中，再于4 ℃下2 000 r/min 离心15 min 取上清液。以BSA 为标准蛋白，使用Lowry 法测定上清液中蛋白质的含量[19]。溶解度的计算公式为：

式中Ps为样品蛋白质的溶解度，%；C上为上清液中的蛋白质含量，mg/mL；C为样品中的蛋白质含量，取1 mg/mL。

1.10 持水性测定

参考MCCONNELL 等[20]的方法并略作修改。取300 mg样品溶于30 mL 去离子水中。再于4 ℃下1 500 r/min 离心15 min 取沉淀，测量其质量。持水性的计算公式为：

式中WHC为样品的持水性，%；W沉淀为沉淀的质量；W为样品的质量，取300 mg。

1.11 持油性测定

参考LIN 等[21]的方法并略作修改。取100 mg 样品溶于20 mL 大豆油中，于25 ℃漩涡振荡15 min 使其充分混匀，再于4 ℃下1 500 r/min 离心15 min 取沉淀，测量其质量。持油性的计算公式为：

式中OHC为样品的持油性，%；W沉淀为沉淀的质量；W为样品的质量，取100 mg。

1.12 起泡性及泡沫稳定性

参考ZHANG 等[22]的方法并略作修改。将样品以1 mg/mL的浓度溶于去离子水中，置于4 ℃冰箱中水化12 h 得到样品溶液。取20 mL 样品溶液置于100 mL 量筒内，使用IKA T18 ULTRA-TURRAX 型高速均质机以12 000 r/min的速度在室温下均质2 min，记录均质结束后0 min 及10 min时的泡沫高度（以量筒刻度为准）。起泡性及泡沫稳定性的计算公式为：

式中FC为样品的起泡性，%；V0为样品溶液均质结束后0 min 时的泡沫高度，mL；V为样品溶液的体积，mL；FS为样品的泡沫稳定性，%；V30为样品溶液均质结束后30 min 时的泡沫高度，mL。

1.13 乳化活性和乳化稳定性测定

参考KINSELLA 等[23]的方法并略作修改。将样品以1 mg/mL 的浓度溶于去离子水中，置于4 ℃冰箱中水化12 h 得到样品溶液。取21 mL 的蛋白溶液与7 mL 的大豆油混合，使用IKA T18 ULTRA-TURRAX 型高速均质机以12 000 r/min 的速度在室温下均质2 min 制得乳液。在乳液制备完成后的0 min 和10 min 时分别测定其吸光值。乳化活性和乳化稳定性的计算公式为：

式中EAI为样品的乳化活性，m2/g；A0为乳液在0 min 时的吸光度；C蛋白为样品溶液中的蛋白质含量，取0.001 g/mL；ESI为样品的乳化稳定性，min：A10为乳液在10 min 时的吸光度；ΔT为两次取样的时间间隔，取10 min。

1.14 激光共聚焦显微镜分析

参考殷静霖等[24]的方法并略作修改。先用异丙醇为溶剂制备1 mg/mL 的耐尔红染料以及10 mg/mL 的耐尔蓝染料，分别过0.22 μm 滤膜以去除不溶性物质。再取1.13 中制得的乳液100 μL 与700 μL 的去离子水混匀后，加入35 μL 的耐尔红染料、40 μL 的耐尔蓝染料。混匀后于避光环境静置30 min 使其充分染色。使用染色的乳液制备激光共聚焦显微镜样片，在550 nm 下激发耐尔红，490 nm 下激发耐尔蓝，于20×的物镜观察并拍摄。

1.15 数据处理与分析

所有的试验重复3 次，结果用平均值±标准差表示，采用SPSS 19.0 软件对试验数据进行ANOVA 显著性分析，P＜0.05 为显著性差异，采用Origin 9 软件作图。

2 结果与分析

2.1 微波对大豆蛋白氧化聚集体粒径分布的影响

由蛋白质的粒径分布能直观地从宏观角度反映物理场作用下蛋白质分子中发生的聚集与解聚现象[25]。微波处理对氧化大豆分离蛋白平均粒径的影响见图1。由图1可知，与SPI 的粒径分布相比，经过AAPH 氧化处理后的OSPI 粒径分布变为三峰分布，原有粒径峰均右移并在更大粒径处形成一个新的峰。这是因为大豆分离蛋白的蛋白质骨架及侧链基团受自由基攻击而附加上侧链基团，导致蛋白质发生了交联聚集[26]。在微波处理后，WOSPI-10 的粒径分布变为双峰分布，当微波处理时间达到40 s 后WOSPI-40、WOSPI-50、WOSPI-60 的粒径分布呈现出小粒径峰降低，大粒径峰右移的趋势，在微波处理时间达到70 s 时，WOSPI-70 的双峰均出现右移。这是因为短时间的微波处理能通过电场等非热效应促进大豆分离蛋白分子运动，增加了分子间碰撞发生概率，使得大豆分离蛋白分子间的非共价键断裂，原有的大粒径的氧化聚集体分子解聚为小粒径的氧化聚集体。而随着微波处理时间的逐渐增加，大豆分离蛋白氧化聚集体碰撞加剧，系统内热效应增强，诱导已经解聚的氧化聚集体分子出现变性，形成了新的化学键，增强了分子间相互作用力，继而导致聚集体的出现，WOSPI 粒径增加[27]。

图1 微波处理时间对大豆蛋白氧化聚集体粒径分布的影响Fig.1 Effects of microwave treatment time on particle size distribution of OSPI (oxidized soybean protein aggregates)

2.2 微波对大豆蛋白氧化聚集体浊度的影响

蛋白质溶液的浊度取决于溶质即蛋白质自身的粒径大小，两者呈正相关，因此常用浊度来表征蛋白质的聚集和解离程度[28]。由图2 可知，与SPI 的浊度相比，经过AAPH 氧化处理后的OSPI 的浊度显著增加（P＜0.05）。这表明氧化处理可能引起蛋白溶液中的大分子氧化聚集体含量升高和粒径增加。随着微波处理时间的增加，WOSPI 的浊度整体上先降低后增加，并在微波处理30 s时达到极小值。这是因为在短时的微波处理中，OSPI 主要受电磁场等非热效应的影响，破坏了维持蛋白空间结构的非共价键，大豆分离蛋白分子间的聚合作用被削弱，导致WOSPI 的浊度在前期呈下降趋势[29]。然而长时间的微波处理下，已经解离出来的小分子氧化聚集体与原有的大分子氧化聚集体的结构被热效应破坏[30]，暴露了蛋白质内部基团，增加了蛋白质分子间的聚合机会，形成了大粒径的大豆蛋白聚集体，最终造成WOSPI 的浊度上升。

图2 微波处理时间对大豆蛋白氧化聚集体浊度的影响Fig.2 Effects of microwave treatment time on turbidity of OSPI

2.3 微波对大豆蛋白氧化聚集体硫黄素T 荧光强度的影响

硫黄素T(Thioflavin T，Th T)能特异性地平行插入纤维状蛋白聚集体内部的分子间反平行β-折叠并与其结合，其荧光强度可以用来表征蛋白质聚集程度的变化。由图3 可知，与SPI 相比，OSPI 的Th T 荧光强度显著升高，说明氧化处理显著增加了大豆分离蛋白中分子间反平行β-折叠结构的含量。这可能是因为氧化处理会使得蛋白质分子通过二硫键等共价键的形成，诱导共价交联，继而通过分子间反平行β-折叠结构形成大分子的氧化聚集体。而经过微波处理后，WOSPI 的Th T 荧光强度随微波处理的时间整体呈现先下降后增加的趋势。这是因为微波处理引发的电场作用等非热效应对大豆分离蛋白氧化聚集体内部的氢键产生了作用，部分氢键断开，进而使得分子间反平行β-折叠结构含量减少[31]。当微波时间超过20 s 以后，大豆分离蛋白氧化聚集体发生变性，蛋白表面的疏水性基团等被修饰，在分子间形成了二硫键、疏水键等，诱导小分子聚集体交联缔合形成大分子的热聚集体。而当微波处理时间达到70 s 时，Th T 荧光强度的下降可能是因为纤维状聚集体的形成已经进入稳定期，生成速度减缓[32]；同时热效应过强，诱导进一步聚集团聚，包埋了部分分子间反平行β-折叠结构，使得Th T 无法与其结合，两者共同导致了荧光强度的下降。

图3 微波处理时间对氧化大豆分离蛋白硫黄素T 荧光强度的影响Fig.3 Effects of microwave treatment time on fluorescence intensity of Th T of OSPI

2.4 微波对大豆蛋白氧化聚集体二级结构的影响

由表1 可知，与SPI 相比，OSPI 的二级结构出现显著变化（P＜0.05），蛋白质有序结构的减少和无序结构的增加表明氧化处理能破坏蛋白原有结构，通过分子间反平行β-折叠形成氧化聚集体[33]。随着微波处理时间的增加，WOSPI 的α-螺旋、β-转角和β-折叠含量均呈现先增加后减少的趋势，而无规则卷曲和分子间反平行β-折叠结构含量则相反。这是因为短时微波处理导致了大豆分离蛋白分子内部的偶极分子与极性侧链间发生高频振荡，诱导部分氢键断裂，增强了大豆分离蛋白的柔性，诱导了聚集体大分子的破碎。之后处理时间增加，存在的电场等非热效应的存在使得分子间碰撞机率大，更容易发生相互作用连接在一起，加速了自组装的过程，因而OSPI 内的无序结构再次增多。AKKERMANS 等[34]研究也表明，分子间的碰撞几率增加会显著促进蛋白聚集体的自组装。但是当微波处理时间达到70 s 时，WOSPI-70 的分子间反平行β-折叠结构开始下降。这可能是因为分子间反平行β-折叠结构主要存在于聚集体核心中，而在微波处理带来的热效应作用下，聚集体形成进入稳定期，不再产生新的聚集体核心，反而转为聚集体之间的进一步聚集[35]。

表1 微波处理时间对大豆蛋白氧化聚集体二级结构的影响Table 1 Effects of microwave treatment time on secondary structure of OSPI

2.5 微波对大豆蛋白氧化聚集体内源荧光强度的影响

由图4 可知，与SPI 相比，OSPI 内源荧光强度显著降低，这说明OSPI 中出现氧化聚集现象[36]。经过微波处理后，WOSPI 的内源荧光强度逐渐降低，最大吸收波长（λmax）先增加后减少，并在30 s 时达到极大值。这表明色氨酸残基发生了荧光猝灭反应，且附近的微环境极性先增加后降低。这可能是因为微波处理导致的电场效应使得大豆分离蛋白分子间布朗运动加强，分子间碰撞增加，继而处于激发态的大豆分离蛋白氧化聚集体分子间发生动态的荧光猝灭效应，导致荧光分子出现光度下降的现象；同时还会断开大豆分离蛋白氧化聚集体内部的疏水键等非共价键，使得内部的色氨酸残基暴露在极性环境中，进而导致λmax出现增加。处理时间过长时，大豆分离蛋白氧化聚集体重新交联形成大分子的热聚集体，色氨酸残基被埋入热聚集体的内部，继而导致λmax降低。

图4 微波处理时间对大豆蛋白氧化聚集体内源荧光强度的影响Fig.4 Effects of microwave treatment time on endogenous fluorescence intensity of OSPI

2.6 微波对大豆蛋白氧化聚集体溶解度的影响

溶解度由蛋白质表面的疏水基团和亲水基团的性质决定，与其起泡性、乳化性等功能性质密切相关[37]。由图5 可知，与SPI 相比，OSPI 溶解度显著降低（P＜0.05）。这是因为在自由基在氧化过程中攻击了大豆分离蛋白的主链和侧链基团，形成了不溶性的氧化聚集体。随着微波处理时间的增加，WOSPI 的溶解度呈现先增加后减少的趋势。这是由于适当的微波处理可以通过其非热效应使得蛋白分子极化，在水中高频振荡，非共价作用等被削弱导致结构更松散，从而使水分子容易进入蛋白内部与其发生水合，继而导致溶解度增加。而微波处理时间进一步延长导致热效应逐渐增强，大量暴露在大豆分离蛋白表面的疏水基团相互作用引发蛋白质发生缔合，导致溶解度下降[38]。WANG 等[39]研究也表明，微波处理可以通过电场作用有效提升蛋白质的溶解度，但热效应增强则会导致蛋白质聚集形成不溶性组分，进而导致溶解度下降。

图5 微波处理时间对大豆蛋白氧化聚集体溶解度的影响Fig.5 Effects of microwave treatment time on solubility of OSPI

2.7 微波对大豆蛋白氧化聚集体持水性的影响

持水性主要受蛋白质的构象等物理结构变化的影响[40]。由图6 a 可知，与SPI 相比，经AAPH 氧化处理后的OSPI 持水性显著下降（P＜0.05）。这是因为氧化会导致蛋白质聚集，形成不溶性的氧化聚集体，使得大豆分离蛋白分子刚性增强，结构稳定性下降，导致持水性下降。微波处理导致的振荡效应使得大豆分离蛋白分子内氢键、疏水键等非共价键断裂，打开了团聚的聚集体结构，使得分子舒展，柔性结构舒张，可以有效地吸附水分子。同时大豆分离蛋白中的β-折叠结构有所增加，水分子更容易嵌入蛋白质空隙中，增强了大豆分离蛋白的持水性。之后微波处理时间延长，热效应诱导小分子聚集体产生热聚集，继而形成大分子的不溶性热聚集体，阻碍了与水分子的接触，导致了持水性出现下降。邓芝串等[41]研究表明，微波处理产生的热效应逐渐增加，大豆蛋白随之出现先展开后聚集的构象变化，持水性也出现了类似变化。

图6 微波处理时间对大豆蛋白氧化聚集体持水性及持油性的影响Fig.6 Effects of microwave treatment time on water and oil holding capacity of OSPI

2.8 微波对大豆蛋白氧化聚集体持油性的影响

持油性是指一定重量的干基蛋白样品对油脂的保持能力，其作用基础来自蛋白质自身的疏水基团[42]。由图6b可知，与SPI 相比，经过AAPH 氧化处理后的OSPI 的持油性显著下降（P＜0.05）。这是因为大豆分离蛋白被氧化形成了氧化聚集体，疏水亲油性基团被包埋，阻碍OSPI与油脂分子结合。LI 等[43]研究也表明氧化会导致蛋白质表面疏水性的降低而降低持油性。随着微波处理时间的增加，WOSPI 的持油性呈现出先增加后减少的趋势，并在30 s 处达到极大值。这是因为短时微波处理中占据主导地位是非热效应，促进大豆分离蛋白氧化聚集体碰撞导致部分解聚，分子内氢键、疏水键等非共价键断裂，蛋白结构舒张，使得原本包埋在内部的疏水亲油性基团暴露到蛋白表面，进而与更多的油脂吸附结合。但是随着微波处理时间的进一步增加，表面的疏水性基团通过疏水相互作用发生交联，同时游离巯基也互相结合形成了二硫键，进而形成了大分子的聚集体，疏水基团重新包埋分子内部，导致不能与油脂充分结合，降低持油性。

2.9 微波对大豆蛋白氧化聚集体起泡性及泡沫稳定性的影响

由表2 可知，与SPI 相比，OSPI 起泡性显著下降，稳定性显著增加（P＜0.05）。这是因为氧化过程中的自由基攻击大豆分离蛋白分子，导致蛋白变性，降低了蛋白柔性，形成了大分子蛋白氧化聚集体，不易在气-水界面展开导致OSPI 起泡性降低[44-45]。经过微波处理后，OSPI 的起泡性随着微波处理时间的增加呈现出先增加后减少的趋势，泡沫稳定性整体来看也有相同趋势，两者分别于微波处理30 s 和20 s 处达到极大值。这是因为在微波的作用下，大豆分离蛋白出现极化现象，内部的非共价键被破坏，导致蛋白舒张展开柔性增强，促进了气-水界面的形成；舒张后的蛋白质在界面膜上形成的网状结构也更加稳定，所以增强了蛋白质的起泡性和泡沫稳定性。当处理时间过长时，热聚集体的形成导致气-水界面膜难以形成并维持，进而导致蛋白质的起泡性和泡沫稳定性出现下降。杨文敏等[46]研究表明，在适当微波处理巴旦木蛋白后，蛋白结构伸展，更容易和水分子结合，提高了蛋白的溶解度，促进了蛋白向气-水界面扩散，继而增强了蛋白的起泡性，这与溶解度的变化相一致。

表2 微波处理时间对大豆蛋白氧化聚集体起泡性及泡沫稳定性的影响Table 2 Effects of microwave treatment time on foaming capacity and foaming stability of OSPI

2.10 微波对大豆蛋白氧化聚集体乳化活性和乳化稳定性的影响

由表3 可知，OSPI 的乳化活性和乳化稳定性比SPI显著降低（P＜0.05）。这可能是因为蛋白质氧化后降低了分子柔性，使得蛋白质与油-水界面难以结合，无法形成稳定的界面膜。随着微波处理时间的增加，WOSPI 的乳化活性及稳定性均呈现先增加后降低的趋势，分别在微波处理30、20 s 处达到极大值。研究表明，微波所产生剪切力和振荡效应等导致氧化大豆蛋白聚集体的解聚和去折叠，蛋白质结构逐渐由有序变为无序，分子柔性增强，蛋白质的两亲性提高。因此，水-油界面的表面张力降低，从而增强了蛋白质的乳化特性。结合前面结果发现，较短时间内微波处理的非热效应使得大豆分离蛋白出现极化现象，破坏了蛋白内部的非共价键，一些不稳定的氧化结构被打开，使得蛋白的刚性减弱，柔性增强；同时非共价键断裂还导致了疏水性增高，促进油-水界面的形成，并诱导大豆分离蛋白更容易结合到油-水界面处吸附油脂并形成膜结构，提升其乳化能力。当微波处理时间继续延长，微波处理产生的热效应逐渐增强，暴露到蛋白质表面非极性基团增加，在非热效应促进的分子碰撞中互相以疏水作用结合形成了更加致密的不溶性热聚集体，阻碍了油-水界面的形成，降低了大豆分离蛋白在界面处的展开能力，进而导致乳化能力下降。

表3 微波处理时间对大豆蛋白氧化聚集体乳化活性及乳化稳定性的影响Table 3 Effects of microwave treatment on emulsifying activity and emulsion stability of OSPI

2.11 微波对大豆蛋白氧化聚集体乳液微观形态的影响

使用尼罗蓝和尼罗红作为荧光染料分布对乳液中的蛋白质和油脂进行染色。由图7 可知，未经微波处理的SPI制成的乳液液滴呈球形，整体分布较为均匀，而OSPI 制备的乳液粒径显著增加，出现了聚集现象。这是因为氧化导致大豆分离蛋白出现了聚集现象并形成了一定量的不溶性聚集体，影响了界面膜的形成和稳定性，降低了OSPI的乳化能力和乳液均一性。随处理时间增加，WOSPI 制备的乳液液滴更小更均一，与粒径结果相一致；当微波处理时间超过30 s 后，乳液液滴出现了粒径增大的絮凝现象，乳液液滴逐渐失去圆形形态，变为不规则的大颗粒。这说明适当的微波处理可以通过振荡等作用使得大分子的氧化聚集体破碎解聚成小分子聚集体，提升其乳化能力，帮助小分子蛋白聚集体吸附到油-水界面上并形成相对稳定的界面膜，进而提升了乳液的均一性。但是当微波处理时间超过30 s 后，WOSPI 乳液出现粒径增大且逐渐聚集的趋势。这说明乳化性正在降低，不能覆盖原有的油-水界面，可能因为长时间微波处理带来的热效应导致了大豆分离蛋白间以二硫键、疏水键等形成聚集，继而消耗并包埋了疏水基团，导致乳化能力降低，影响乳液稳定性和形成不规则的大分子乳液液滴。TENG 等[47]的研究表明，长时间微波处理带来的强热效应使得大豆蛋白形成了大分子聚集体，进而导致制备的乳液间也发生了一定的絮凝，形成了大小不一的乳液液滴。

图7 微波处理对大豆蛋白氧化聚集体乳液激光共聚焦显微镜图的影响Fig.7 Effects of microwave treatment on the picture of OSPI emulsion by CLSM

3 结论

本研究以大豆蛋白为原料，采用偶氮二异丁脒盐酸盐（2,2′-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride，AAPH）制备大豆蛋白氧化聚集体，然后探讨不同时间的微波处理技术对其结构和功能特性的影响。结果表明：氧化处理破坏大豆蛋白的结构，暴露其疏水性基团，并通过疏水相互作用形成二硫键，引起粒径和浊度增大，形成大分子氧化聚集体，进而导致功能活性下降；短时间（＜30 s）的微波处理可以促进大豆蛋白氧化聚集体发生解聚，引起粒径和浊度减小，增强了分子柔性，无序结构减少，同时诱导蛋白结构舒张展开，包埋在蛋白内部的疏水基团和带电基团暴露，结合位点增多，进而导致持水性，持油性提高，增强了蛋白的界面性质，导致起泡性和乳化活性的提高；而长时间（＞30 s）的微波处理带来的热效应增加，会导致解聚的氧化聚集体通过共价和非共价相互作用形成二硫键，包埋了表面的疏水性基团和带电基团并形成了致密的大分子热聚集体，阻碍了水分子和油脂分子与大豆蛋白氧化聚集体的结合，导致其持水性、持油性下降，这也对大豆蛋白氧化聚集体的乳化性质、泡沫性质产生了一定的负面影响，可为今后的研究中继续探讨微波作用中热效应和非热效应分别对于大豆蛋白的影响提供一定的理论基础。本研究结果阐明了不同微波处理时间对大豆蛋白氧化聚集体功能性质及结构的影响，为大豆蛋白氧化聚集体功能性质的改善及微波在氧化聚集体行为调控的应用方面提供参考。