芦笋胆固醇C-22羟化酶基因 AoCYP90B27的克隆及表达模式分析

张永辉,刘正杰,2,成 钦,黎玉萍,毛自朝,2,黄 玲,林 春,2

(1.云南农业大学 农学与生物技术学院, 昆明 650201;2.云南农业大学 特色小宗作物研究中心,昆明 650201;3.四川省农业科学院 经济作物育种栽培研究所,成都 610300)

芦笋(AsparagusofficinalisL.)为天门冬科天门冬属食药同源的名贵蔬菜,具降血脂、降血压、软化血管和增强免疫力的功能[1-2]。研究发现芦笋提取物对癌症细胞,特别是食道癌、膀胱癌、肺癌等细胞有较显著的抑制作用,被认定为优良的抗癌蔬菜[3-4]。目前已确定芦笋中具抗癌、降脂活性的主要化合物是甾体及其皂苷[5-6],甾体皂苷在天门冬属如芦笋、天门冬(Asparaguscochinchinensis)、薯蓣(Dioscoreaopposite)和菝葜(Smilaxchina)等植物中含量丰富[7]。自首次从白芦笋茎基部分离甾体皂苷以来,新的甾体皂苷不断被分离[8]。芦笋地上部主要含原薯蓣皂苷,而芦笋地下部主要含有菝葜皂苷元、雅姆皂苷元及天冬宁,这些皂苷在芦笋根盘(crown)和肉质贮藏根中含量最高[3]。在植物中,胆固醇是合成油菜素内脂(BRs)、甾体皂苷(steroidal sapnion)及甾体糖苷生物碱(SGAs)的关键中间物[9]。目前芦笋中胆固醇合成及随后的皂苷元合成及调控途径的研究尚未见报道。通过对模式植物的研究确定甾体皂苷合成下游途径主要包括胆固醇在细胞色素依赖氧化酶/羟化酶(Cytochrome 450,CYP450)和α-酮戊二酸依赖的氧化酶/羟化酶(2OGD)催化的胆固醇碳骨架不同位点的羟基化修饰[10-12],羟化胆固醇在甲基转移酶[13]、酰基转移酶[14]和糖基转移酶[15-16]催化的羟基位点进行甲基化、乙酰化和糖基化等修饰最终合成多样的皂苷元。

皂苷包括甾体皂苷、三萜皂苷等广泛分布于植物[17]和许多海洋物种中[18]。皂苷可作为抗真菌剂、光保护剂、活性氧清除剂,是植物天然免疫促进物质,能提高植物抗逆能力[19-20]。研究表明,皂苷含量更多的转基因蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)在盐胁迫下有更好的长势[21]。在将5%皂苷作为生物引发剂处理大豆[Glycinemax(Linn.)Merr.]种子时,能提高大豆的抗氧化能力、渗透压代谢进而赋予大豆更高的耐盐性[22]。目前,甾体皂苷合成途径中胆固醇羟化酶基因陆续被发现,在加州藜芦(Veratrumcalifornicum)的甾体生物碱合成研究中,首次确定VcCYP90B27(GenBank:AJT59559.1)是专一催化胆固醇22α羟基化,形成 22(R)-羟基胆固醇的羟化酶[23]。在滇重楼(Parispolyphylla)甾体皂苷合成研究中,克隆了加州藜芦的VcCYP90B27同源的PpCYP90B27(KX904822)基因,并确定为云南重楼中的胆固醇C-22羟化酶[24]。然而在芦笋中至今未见克隆甾醇羟化酶基因及其在抗旱方面作用的报道。

本研究首先通过同源预测,芦笋CYP450基因组家族及转录组测序的基因表达分析,预测到芦笋中 3个 芦笋胆固醇C-22羟化酶基因(AoCYP90B1N1、AoCYP90B2N1和AoCYP90B 2N2)。克隆其中的AoCYP90B1N1,命名为AoCYP90 B27,经生物信息学分析该基因编码序列及启动子序列的特征,通过qRT-PCR确定其在芦笋不同组织部位的表达情况,进一步基于其启动子元件中预测到脱落酸(Abscisic acid,ABA)、水杨酸(Salicylic acid,SA)和茉莉酸甲酯(Jasmonic acid methylester,MeJA)的相应元件等,通过ABA、SA、MeJA及PEG模拟干旱处理下,该基因根系表达模式分析,预测AoCYP90B27为芦笋甾体皂苷合成下游胆固醇的22羟化酶基因,为芦笋皂苷的合成以及基于皂苷合成的芦笋抗逆优质品种培育提供试验基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

供试芦笋材料为‘格尔夫’品种,种植于云南农业大学后山农场。在芦笋母茎开花时期,取拟叶、母茎、根和花部位样品,立即用液氮速冻,于-80 ℃冰箱保存备用。

Taq酶、TB GREEN Premix EXTaqⅡ荧光定量试剂盒、pMD18-T载体购置于TaKaRa公司; 琼脂糖凝胶回收试剂盒、反转录试剂盒购置于天根生物有限公司。引物合成与测序由北京擎科生物技术有限公司完成,PEG 6000等其他分析纯试剂从昆明云科生物技术有限公司购买。

1.2 试验方法

1.2.1 芦笋的CYP450超基因家族分析 以Phytozone芦笋基因组(AsparagusofficinalisV1.1)数据(https://data.jgi.doe.gov/refine-download/phytozome?organism= Aofficinalis & expanded=498)中最长转录本为基础,提取出芦笋基因组中全部的124个CYP450基因的编码蛋白,用RAxML(https://github.com/stamatak/standard-RAxML)以最大似然法对所获序列进行建树,将建树后获得的结果在进化树编辑网站ITOL(https://itol.embl.de/)上进行修饰,进行芦笋CYP450超基因家族家族分析。

1.2.2 芦笋基因组的AoCYP90B27基因的生物信息学分析 将获得的CYP85部族的90B亚家族基因与已知功能的日本晴水稻(Oryzasativajaponicagroup)OsCYP724B1、番茄(Solanumlycopersicum)SlCYP724B1、胡杨(Populuseuphratica)PeCYP90B1、棉花(Gossypiumhirsutum)GhCYP90B1、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)MtCYP90B1、木豆(Cajanuscajan)CcCYP90B1、紫松果菊(Echinaceapurpurea)EpCYP90B1、拟南芥(Arabidopsisthaliana)AtCYP90B1、玉米(Zeamays)ZmCYP90B1、滇重楼(Parispolyphylla)PpCYP90B27、加州藜芦(Veratrumcalifornicum)VcCYP90B27、马铃薯(Solanumtuberosum)StCYP72A188、匍匐筋骨草(Ajugareptans)ArCYP71D443等C-22羟化酶基因用最大似然法RAxML构建系统发育树。

利用Protparam在线软件(https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protpara)预测蛋白序列等电点和分子质量等理化性质;NCBI在线CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)预测氨基酸序列保守结构域;SOPM在线软件(https://npsa-prabi.Ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl)预测蛋白质二级结构;SignalP 4.1 Server在线预测(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)信号肽;在线程序AlphaFold(https://colab.research.google.com/github/deepmind/alphafold/blob/main/notebooks/AlphaFold.ipynb)预测蛋白质的三级结构;参考芦笋基因组在线测序信息https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/10978);MEME在线软件(https://meme-suite.org/meme/)预测氨基酸序列的motif;调取AoCYP90B27起始密码子上游2 000 bp的启动子序列,使用PlantCARE在线软件进行启动子序列分析。

1.2.3 总DNA、RNA的提取及cDNA的合成 样品总DNA和总RNA用提取试剂盒(中科雷鸣,北京)进行提取,根据反转录试剂盒(宇恒生物,苏州)的操作流程制备cDNA,并于-20 ℃保存,用于后续试验。

1.2.4AoCYP90B27基因的克隆 用AoCYP90B27(LOC109833124)CDS设计特异引物AoCYP90B27F和AoCYP90B27R(表1),以根部的cDNA进行RT-PCR扩增。将PCR产物与pMD18-T载体连接,连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α,挑取经PCR鉴定的阳性克隆,提取质粒后送样测序。

表1 引物序列

1.2.5 实时荧光定量qRT-PCR分析 提取芦笋根、母茎、拟叶、花,及上述不同时间的胁迫处理的总RNA,反转录合成第一条cDNA,根据Abdelrahman等[25]的方法,以芦笋elongation factor 1-alpha(eEF1A)持家基因作为内参,用引物eEF1A F1、eEF1A RI和qAoCYP90B27F1、qAoCYP90B27R1进行样品定量real-time PCR分析,重复3次,基因相对表达量采用2△△Ct法进行计算。

1.2.6 ABA、MeJA和SA激素及PEG模拟干旱处理芦笋幼苗的方法 芦笋种子温水搓洗后温水浸泡1～2 d,取出洗净,置于温室的培养皿中室温萌发出苗。将发芽的芦笋种子转入育苗盘,置于光照培养箱中(光周期12 h、暗周期12 h)25 ℃培养30 d后移栽至小盆中,挑选长势一致且健壮的芦笋幼苗,用20% PEG作为模拟干旱处理幼苗,以及用100 μmol·L-1ABA、100 μmol·L-1MeJA和5 μmol·L-1SA对芦笋的拟叶进行喷施处理,处理时间均为0、3、6、9、12、24 h,处理后取相同部位的根部用于qRT-PCR测定(方法同“1.2.5”),重复3次。

1.3 数据分析

用Excel 2016及R进行数据处理,用RAxML软件进行最大似然法系统发育树构建,用TBtools软件进行motif、CDS结构可视化分析,用GraphPad Prism 8 软件绘制图,采用PyMOL软件进行蛋白质三级结构可视化。

2 结果与分析

2.1 芦笋CYP450基因家族中胆固醇C-22羟化酶的预测与筛选

芦笋基因组的测定为胆固醇C-22羟化酶基因的筛选提供了良好的基础[26]。通过芦笋基因组家族分析,获得 124个 CYP450 超家族基因,分属 CYP450 的 71,72,85,86,89,78,711 等部族(clan),其中 71,72,85,86 部族含多家族。其中最具有代表性的是家族85,其中包含90B分支(图1-A、1-B)。利用马铃薯、拟南芥、水稻等模式植物中甾醇醇C-22羟化酶序列,进行blast分析(identity>40%,evalue=1e-6,coverage= 0.8),获得芦笋甾体皂苷下游甾醇C-22羟 化 酶同源基因4个。再与功能确定的胆固醇C-22羟化酶基因进行进行同源分析,最终预测到3个羟化酶(AoCYP90B1N1、AoCYP90B2N1和AoCYP90B2N2)基因。候选基因AoCYP90BIN1与VcCYP9027B和PpCYP90B27亲缘关系近,氨基酸同源性分别为79.8%和76.0%,构建的进化树中也聚为同一分支(图1-C),从而预测为胆固醇 C-22 位羟化酶。Motif结构域分析结果表明(图1-C),进化树所有基因都含有相同的motif 3和motif5,所有的CYP90B1基因都拥有6个motif,其中motif3中包含一个所有CYP450家族基因特有的半胱氨酸血红素铁配体标记(cysteine heme-iron ligand signature,FSGGPRLCPG),CDD分析结果表明AoCYP90B1N1和VcCYP90B27、PpCYP90B27也都被预测为CYP90-like基因家族成员。

A.芦笋CYP450超基因家族分析;B.CYP85部族进化树分析;C.候选基因与其他物种的22羟化酶的进化树分析(前),motif分析(中),CDD(后)分析

2.2 AoCYP90B27基因的克隆、序列及启动子顺式作用元件分析

以‘格尔夫’根部cDNA为模板对AoCYP90B1N1基因进行克隆,凝胶电泳结果显示在1 000～2 000 bp有一个单一目的条带,基因扩增成功,命名为AoCYP90B27(图2)。通过Prot-param在线软件分析,AoCYP90B27的开放阅读框全长1 443 bp,蛋白分子质量为54.5 ku,编码52个带正电荷的氨基酸残基和54个带负电荷氨基酸残基,等电点4.99,不稳定系数为42.31,属于不稳定蛋白。用在线TMHMM分析蛋白结构,第22～481位氨基酸位于细胞膜质侧,在5～22位氨基酸之间存在一个跨膜结构螺旋区。信号肽预测发现在21～22位氨基酸位点存在一个信号锚的序列,AoCYP90B27是一个膜内蛋白,定位于细胞膜的胞质侧。AoCYP90B27蛋白的三级结构与VcCYP90B27的RMSD(Root Mean Square Deviation,RMSD)有最小值0.302,与PpCYP90B27的RMSD值0.370次之,与拟南芥(Arabidopsisthaliana)AtCYP90B1蛋白的晶体结构(PDB ID:6A15.1)RMSD有最大值0.646,说明AoCYP90B27蛋白的三级结构与VcCYP90B27相似(图3-A～图3-D)。

M.DNA marker,大小分别为2 000 bp、1 500 bp、1 000 bp、500 bp、250 bp、100 bp;1. AoCYP90B27基因扩增结果(1 443 bp)

A. AtCYP90B1三级结构(PDB ID:6A15.1);B. VcCYP90B27三级结构预测;C. PpCYP90B27三级结构预测;D. AoCYP90B27三级结构预测

通过PlantCARE在线软件分析AoCYP90B27基因的启动子上顺式作用元件(表2)。该基因启动子序列主要含有CAAT-box、TATA-box、CAAT-box等真核生物高度保守的调控元件、ATCT-motif、GATA-motif、G-box、GT1-motif、GTGGC-motif及Sp1等光响应元件,以及干旱相关的MYB结合位点MBS、ABRE、P-box与MeJA响应的调控元件CGTCA-motif、赤霉素响应元件TATC-box、水杨酸响应元件TCA-element等激素响应元件及厌氧响应元件ARE,说明AoCYP90B27可能受干旱、光和激素等多种环境信号的调控,预示芦笋皂苷合成,可能调控根系适应或抵抗多年生的微生物土壤环境等生物学过程来调控其特定的根系生长发育过程。

表2 芦笋 AoCYP90B27基因启动子调控区元件

2.3 芦笋 AoCYP90B27基因组织表达模式分析

基于课题组前期的转录组数据,对全部芦笋CYP85家族的基因在两性株芦笋和雌株芦笋的不同组织部位进行基因表达模式分析(图4-A),结果表明,含有包括AoCYP90B27和AoCYP90B2N1基因在内甾醇C-22羟化酶家族基因在两性株和雌株芦笋的根、茎和花中差异表达,这2个基因均在根部表达量最高,母体茎次之。进一步通过qRT-PCR验证AoCYP90B27基因在根、母体茎、花和拟叶的组织均能表达(图4-B),结果表明,AoCYP90B27基因在根、母体茎、拟叶、花器官中表达量明显不同,根系表达量最高,比其他地上部组织的表达量高17.98倍。母体茎、花和拟叶中的表达量均特别低,且地上部三者之间没有显著性差异,与芦笋转录组测序数据中该基因的相对表达量的结果一致(图4-A)。

HF1～HF3.两性株花组织;HS1～HS3.两性株茎组织;HR1～HR3.两性株根组织;FF1～FF3.雌株花组织;FS1～FS3.雌株茎组织;FR1～FR3.雌株根组织;**表示差异极显著(P<0.01),下同

2.4 干旱胁迫、ABA、MeJA、SA激素处理下 AoCYP90B27基因的表达情况分析

由于AoCYP90B27基因启动子含有ABRE、P-box、CGTCA-motif、TATC-box、TCA-element等激素响应元件;MBS干旱响应元件和ARE厌氧响应元件。通过ABA、MeJA和SA激素及PEG模拟干旱处理芦笋幼苗。结果表明,不同激素及干旱处理下,处理不同时间,芦笋根部的AoCYP90B27基因的表达量存在明显差异。PEG模拟干旱胁迫处理(图5-A),AoCYP90B27基因的表达量随处理时间的延长,表达量逐渐升高,于9 h表达量达最高,为4.392,之后快速下降。ABA处理(图5-B),AoCYP90B27基因在12 h处理之前基因的相对表达量均在1以下小幅度波动,12 h处理时表达量达最大,之后表达量也呈现快速下降趋势。MeJA激素处理下(图5-C),该基因随着处理时间的推进,表达量逐渐增加,24 h处理时基因表达量最高,高达7.985 5。SA激素处理下(图5-D),随处理时间的推进,基因表达量逐渐增加,于9 h时表达量最高,之后表达量下降,但处理24 h时表达量又有所增加,但与12 h的处理没有显著差异。

ns表示差异不显著;*表示差异显著(P<0.05)

3 讨 论

CYP450s是介导多种生物途径产生初级和次级代谢产物合成转化的关键催化酶,如参与苯丙烷类、生物碱、皂苷、脂质、芥子油苷、植物激素、信号分子等合成与转化[27]。在植物中, CYP450s一般分为A型或非A型[28-29]。A型起源于单一祖先,已被发现在次级代谢物和天然化合物或植物特异性化合物的合成中发挥重要作用,以适应生物和非生物胁迫条件[30]。而不同植物物种中的非A型细胞色素P450家族对生物和非生物耐盐性起着重要作用[31], 如CYP85部族(clan)。本研究根据芦笋基因组数据注释信息一共挑选出124个CYP450基因,归属14个部族(clan),其中CYP85部族包括4个CYP90B亚家族基因。前人研究结果表明,CYP90B基因参与植物甾体皂苷及油菜素类脂的合成[32-33]。对AoCYP90B27和其他物种C-22羟化酶基因的进化树分析结果表明,AoCYP90B27与VcCYP90B27、PpCYP90B27聚在同一分支上,有高于70%同源性;motif分析结果表明,在芦笋基因组中,芦笋CYP90B家族基因与其他物种的C-22羟化酶基因序列特征相似性较高;NCBI-CDD预测结果也将AoCYP90B27划分为CYP90-like家族。因此,预示AoCYP90B27在甾体皂苷合成过程中能催化胆固醇C-22羟基化,响应生物和非生物 胁迫。

AoCYP90B27基因启动子含有多个与光、干旱、激素ABA、MeJA、SA及防御响应诱导的结构元件。在外源ABA、MeJA、SA激素处理下,芦笋根部AoCYP90B27基因被诱导表达,且表达模式存在差异。而在MeJA处理下基因的表达稳步提高,在24 h达到最大值, 这与前人报道的结果相似[34-35],MeJA可以诱导皂苷合成中CYP450家族基因的表达。组织特异性表达分析发现AoCYP90B27在芦笋各个组织器官中均有表达, 但在根中表现出较高的差异表达,其次是母体茎。前人研究结果表明,皂苷是植物适应环境、抵抗逆境的一种物质基础[36-37]。AoCYP90B27在根部的特异性表达和被干旱、MeJA、ABA、SA等激素诱导表达,说明AoCYP90B27在受干旱等非生物胁迫的诱导下会在根部过量表达,能使皂苷合成下游的胆固醇C-22羟化反应速率加快,促使多年生芦笋根系皂苷的积累,以适应土壤固化环境的生长发育,进而提高芦笋的抗旱能力。植物在受干旱、寒冷等非生物及生物胁迫下,调节体内的MeJA、ABA、SA含量,促进激素合成途径基因的表达,快速响应来提升抗寒、抗旱能力[38-40]。在模拟干旱胁迫下,AoCYP90B27被干旱诱导表达,这与Zhou等[41]报道的结果一致。

本研究通过芦笋基因组家族结合转录组分析,预测到属于CYP450超基因家族的关键胆固醇C-22羟化酶AoCYP90B27基因,该基因启动子含有ABA、MeJA、SA激素和干旱响应元件,通过基因表达模式及非生物胁迫处理,初步发现该基因受干旱胁迫及激素诱导在根中呈现不同的表达模式,推测AoCYP90B27在受到非生物胁迫的诱导下能被诱导表达,促使甾体皂苷的积累以提高多年生芦笋根部适应土壤干旱环境或抵抗土壤中非生物胁迫的抗性,这个结论有待后期试验进行验证。