NMM肿瘤DNA疫苗乙二胺四乙酸二钠残留量高效液相色谱检测方法的建立及验证

孙澳，郭润姿，田园，伊君梅，柯尊阳，宋卫卫，邱创钧，李忠明，王宇，于继云

固安鼎泰海规生物科技有限公司，河北廊坊065000

NMM［N：纽约食管鳞状细胞癌1（New York esophageal squamous cell carcinoma 1，NY-ESO-1）；M：黏蛋白1（mucin 1，MUC-1）；M：黑色素瘤抗原家族A3（melanoma-associated antigen gene-A3，MAGE-A3）］肿瘤治疗性DNA 疫苗裸质粒注射液（简称NMM 肿瘤DNA 疫苗［1］），属于重组生物制品，主要针对黑色素瘤、淋巴癌、乳腺癌等体表实体瘤的治疗，终产品为质粒DNA。DNA 疫苗属于第三代疫苗技术［2］，其优点是注射至机体内可诱导机体产生细胞和体液的双重免疫效果。随着DNA 疫苗、基因治疗制品等生物制品的进一步发展，质粒DNA 临床用量需求增加，对其质量控制提出了更高的要求，以提高临床用药的安全性［3-5］。NMM 肿瘤DNA 疫苗生产过程中，在发酵菌碱裂解步骤以及色谱纯化过程中添加了乙二胺四乙酸二钠（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na），主要作用是螯合金属离子，如Mg2+，并抑制脱氧核糖核酸酶对DNA 的降解［6］。在纯化工艺过程中EDTA-2Na会逐步被稀释，但不排除终产品中仍存在EDTA-2Na残留的可能。

EDTA-2Na在制药领域中应用范围较广，主要作为螯合剂［7］、稳定剂［8］。EDTA-2Na 收录于美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）《非活性组分指南》［9］，可用于非注射剂和注射给药制剂，若摄入过多EDTA-2Na，会与身体中的钙离子形成水溶性金属络合物，随体液排出，引起低血钙或骨钙流失，导致抽搐甚至死亡［10］。因此需要对注射液中EDTA-2Na残留量进行控制。

目前针对EDTA的检测方法有液相法、气相法、电分析法等［11］，本研究参照相关文献［12-13］，建立了检测NMM肿瘤DNA疫苗原液中EDTA-2Na残留量的高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）法，其原理为EDTA-2Na 与CuSO4在酸性条件下发生络合反应，形成EDTA-Cu络合物，该络合物在254 nm附近有较显著紫外吸收，本研究以水-10%四丁基氢氧化铵-乙腈溶液（74.5∶0.5∶25）为流动相，使用紫外检测器，采用外标法对EDTA-2Na进行检测，为NMM肿瘤DNA疫苗及同类产品质量控制提供参考。

1 材料与方法

1.1疫苗及溶剂 DNA疫苗原液（DNA含量：0.96mg／mL；小试原液批号：Bulk20200501、Bulk20200502、Bulk20-200603，中试原液批号：Bulk20200601、Bulk20200602、Bulk20200703、Bulk20200704、Bulk20200805）及原液空白溶剂（DNA溶解液，主要成分为：13.6 mmol／L磷酸氢二钠、3.2 mmol／L磷酸二氢钠、6 g／L氯化钠）由本公司提供。

1.2主要试剂及仪器 EDTA-2Na（批号：190729-1，含量≥99.0%）购自广东西陇科学股份有限公司；10%四丁基氢氧化铵溶液（分析级）、硫酸铜（分析级）购自天津市致远化学试剂有限公司；乙腈（色谱级）购自美国Thermo Fisher Scientific；硫酸（分析级）购自卢龙县双益磷化有限责任公司；水（二级反渗透）为本公司自制纯化水；磷酸氢二钠（药用级）、磷酸二氢钠（药用级）购自湖南九典制药股份有限公司；氯化钠（药用级）购自河北华晨药业有限公司；高效液相色谱仪（日立Chromaster，配有四元泵、在线脱气机、自动进样器、UV 检测器及Clarity 色谱工作站）购自日本日立公司；色谱柱［ZORBAX SB-C18（150 mm ×4.6 mm，5µm）］购自美国安捷伦公司；PB-10 pH 计、BSA124S电子天平购自德国赛多利斯公司；UV 1800PC紫外分光光度计购自上海菁华科技仪器有限公司。

1.3EDTA-2Na残留量检测方法的建立

1.3.1溶液配制 取EDTA-2Na对照品0.1 g，置100 mL量瓶中，用超纯水溶解稀释至刻度，制成1 mg／mL对照品溶液母液。取该溶液200µL，加入560µL 0.1%硫酸铜溶液，加水定容至2 mL，混匀，作为对照品溶液。分别取DNA疫苗原液200µL、原液空白溶剂200µL，同方法制备供试品溶液及空白溶剂；取DNA 疫苗原液200 µL，对照品溶液母液200 µL，同方法制备含EDTA-2Na的供试品溶液。

1.3.2色谱条件 流动相为水-10%四丁基氢氧化铵-乙腈溶液（74.5∶0.5∶25，用硫酸调pH 至4.0）；流速为0.8 mL／min；检测波长为254 nm；柱温为20 ℃；进样量为20µL；样品放置温度为10 ℃。

1.4方法的验证

1.4.1检测波长的确认 对流动相、空白溶剂、原液空白溶剂、对照品溶液（超纯水稀释3 倍）及供试品溶液（超纯水稀释9 倍）在190 ～400 nm 波长范围内进行扫描，以确认其最优检测波长。

1.4.2专属性 DNA 疫苗原液对光照、温度等条件敏感，质粒DNA解超螺旋构型的条件分别为：5 000 lx光照5 d，获得光照解超螺旋供试品；40 ℃高温15 d，获得高温解超螺旋供试品。分别对流动相、空白溶剂、原液空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液、光照解超螺旋供试品溶液、高温解超螺旋供试品溶液、加入EDTA-2Na 的供试品溶液，按照1.3.2 项色谱条件进行检测，记录色谱图。

1.4.3检测限及定量限 取对照品溶液母液，加水稀释至不同浓度，与硫酸铜络合后，按照1.3.2 项色谱条件依次进样检测并记录信噪比。当EDTA-2Na 峰信噪比为3∶1时，溶液的浓度即为该方法的检测限，对该浓度溶液连续检测3次；当EDTA-2Na 峰信噪比为10∶1 时，溶液的浓度即为该方法的定量限，对该浓度溶液连续检测6次，计算峰面积RSD。

1.4.4线性范围 分别取1 mg／mL对照品母液8、40、100、200、400、800µL，加入560µL 0.1%硫酸铜溶液，超纯水定容至2 mL，混匀过滤即得4、20、50、100、200、400µg／mL系列对照品溶液，按照1.3.2项色谱条件进行检测。以浓度（µg／mL）为横坐标，峰面积（mAU·s）为纵坐标，进行线性回归。

1.4.5溶液稳定性 取对照品和供试品溶液，分别于10 ℃放置0、2、4、6、8、10、12 h，按照1.3.2项色谱条件进行检测，记录峰面积，并计算RSD。

1.4.6耐用性 分别改变流动相比例（水-10%丁基氢氧化铵-乙腈比例分别为79.5∶0.5∶20、74.5∶0.5∶25、69.5∶0.5∶30）、流速（0.6、0.8、1.0 mL／min）、柱温（16、20、24 ℃），其他条件不变，评估测定条件发生微小变动时检测结果不受影响的程度。

1.4.7准确度 分别取1 mg／mL EDTA-2Na对照品母液160、200、240µL，置2 mL容量瓶中，分别取200µL供试品、560µL 0.1%硫酸铜溶液，加水定容至刻度，混匀后过滤即得EDTA-2Na浓度为0.08、0.10、0.12mg／mL的加标溶液（即加标量为80%、100%、120%），每个浓度加标样品制备3 份，每份样品检测1 次，记录峰面积，计算EDTA-2Na含量及回收率。

1.4.8精密度 取EDTA-2Na 对照品溶液，连续检测6次，计算峰面积均值及RSD，评价方法的重复性；取6 份供试品溶液，每份供试品溶液各检测1 次，另配制6份含EDTA-2Na的供试品溶液，各检测1次，计算EDTA-2Na峰面积RSD，评价方法的中间精密度。

1.5方法的初步应用 用建立的方法检测DNA 疫苗3批小试原液及5批中试原液中EDTA-2Na残留量。

1.6数据采集及分析 使用TeChrom色谱工作站（reliminary 版本8.4.0.46）采集数据，所有检测结果由Microsoft Excel 2016 软件进行一般计算，标准曲线采用OriginPro 2021版绘制。

2 结果

2.1方法的验证

2.1.1检测波长的确认 流动相、空白溶剂、原液空白溶剂在254 nm 附近吸光度值极低或无吸光度值；对照品溶液在254 nm 附近有较高吸光度值；供试品溶液在254 nm附近有最高吸光度值。见图1。

图1 流动相（A）、空白溶剂（B）、原液空白溶剂（C）、对照品溶液（D）、供试品溶液（E）波长扫描结果Fig.1 Wavelength scanning results of mobile phase（A），blank solvent（B），bulk blank solvent（C），control solution（D）and sample solution（E）

2.1.2专属性 EDTA-2Na对照品溶液的保留时间为

5.26 min；流动相、原液空白溶剂、空白溶剂在EDTA-2Na 保留时间附近无吸收峰，表明3 种溶液对EDTA-2Na检测无干扰；供试品溶液、光照解超螺旋供试品溶液、高温解超螺旋供试品溶液在5.3 min附近未出现目标峰，供试品经光照、高温等试验条件处理后，对EDTA-2Na残留量检测无影响；供试品溶液运行50 min，目标峰后未见其他峰出现，表明该方法运行15 min内可将所有物质洗脱下来，且供试品溶液中质粒DNA在该色谱条件下未出峰；对连续6针含EDTA-2Na的供试品溶液检测发现，EDTA-2Na的回收率为102.50%，表明质粒DNA虽然在254 nm附近有紫外吸收峰，但在该色谱条件下并未出峰，且不干扰EDTA-2Na的检测。见图2。

图2 专属性验证色谱图Fig.2 Chromatograms of specificity verification

2.1.3检测限及定量限 信噪比为3∶1和10∶1时的溶液浓度分别为10 和40 ng／mL，确定该方法检测限为10 ng／mL，定量限为40 ng／mL。对定量限浓度溶液连续进样6次检测，峰面积RSD为6.84%，＜10%，表明定量限浓度检测较准确。

2.1.4线性范围 EDTA-2Na 对照品溶液浓度在4 ～400µg／mL范围内，与峰面积呈良好的线性关系，线性回归方程为y=12.114x-19.245，R2=0.999 9。见图3。

图3 HPLC法检测EDTA-2Na含量的标准曲线Fig.3 Standard curve for determination of EDTA-2Na by HPLC

2.1.5溶液稳定性 EDTA-2Na 对照品溶液在10 ℃下放置12 h，峰面积的RSD为1.45%，溶液稳定性良好。供试品溶液在10 ℃条件下放置12 h，未出现目标峰及其他峰，表明供试品溶液稳定性良好。见表1。

表1 对照品溶液稳定性验证Tab.1 Verification for stability of control solution

2.1.6耐用性 流动相比例对EDTA-2Na 保留时间有影响，乙腈比例越大，EDTA-2Na保留时间越短，乙腈比例越小，EDTA-2Na保留时间越长，见图4。流速越大，保留时间越短，峰面积越小，见图5。柱温对保留时间及峰面积均无显著影响，见图6。表明方法检测条件发生微小变动时，对检测结果的影响均在可接受范围内，方法耐用性良好。

图4 不同比例流动相色谱图Fig.4 Chromatograms of different ratios of mobile phase

图5 不同流速色谱图Fig.5 Chromatograms in different flow rates

图6 不同柱温色谱图Fig.6 Chromatograms at different column temperatures

2.1.7准确度 低、中、高浓度加标样品EDTA-2Na回收率分别为101.11%、101.60%、101.42%，RSD分别为0.44%、0.27%、0.42%。9 份加标溶液的回收率均值为101.38%，RSD均值为0.39%。见表2。表明该方法准确度良好。

表2 EDTA-2Na加标回收率试验Tab.2 Spike recovery rate of EDTA-2Na

2.1.8精密度 0.1 mg／mL EDTA-2Na对照品溶液，连续进样6次，其峰面积的RSD为0.04%，重复性良好。6份供试品溶液均未检出EDTA-2Na，含EDTA-2Na 的供试品溶液峰面积RSD为0.02%，中间精密度良好。

2.2方法的初步应用 8 批DNA 疫苗原液均未检出EDTA-2Na残留量（图略），表明本公司生产工艺可有效去除生产过程中添加的EDTA-2Na。

3 讨论

EDTA 是一种常用的氨羧络合剂，目前国内外HPLC 法检测EDTA-2Na 残留量主要应用于化学药品［12-16］和食品领域［17-18］，但在重组生物制品的检测控制中报道较少［19-21］。文献中多使用Fe3+［15，17-21］或者Cu2+［12-13，22］作为络合剂检测EDTA-2Na残留量。EDTA易与金属离子络合，可与色谱柱内侧不锈钢表面发生络合反应，从而降低EDTA的响应值［15］。由于EDTA与Fe3+形成的络合物稳定系数高于EDTA 与Cu2+［17］，可考虑使用Fe3+代替Cu2+。也有文献报道，使用Sephadex G-10色谱柱可直接检测EDTA-2Na［16］。

本研究在对检测波长进行扫描时发现，Cu2+浓度会影响EDTA 的最适波长。通过对硫酸铜添加量的研究，确定硫酸铜终浓度为0.28 mg／mL 时，既可保证EDTA 完全络合，又可避免过量Cu2+对络合物吸光度值的影响。

《中国药典》四部（2020版）收录了依地酸二钠药用辅料的质量标准［23］，但目前并未收录注射液中EDTA-2Na 的控制限度。有文献报道，EDTA-2Na 的安全浓度为5 ～100 µg／mL［24-25］。参照国家药品监督管理局药品评审中心的常用药用辅料数据库中依地酸二钠常用量以及最大用量，确定原液中EDTA-2Na残留量的企业控制标准为不高于0.01%。本研究结果显示，多批次原液中均未检测出EDTA-2Na 残留量，该质量标准制定较为合理。

本研究方法验证结果显示，专属性、线性范围、溶液稳定性、精密度以及耐用性均良好，检测限为10 ng／mL，定量限为40 ng／mL，加标溶液平均回收率为101.38%，表明该方法稳定可靠，精密度良好，可适用于测定NMM肿瘤DNA疫苗中EDTA-2Na的残留。