复方紫云膏制备工艺的优化及质量评价

王一帆，熊 雄，李 皓，陈 婷**

(1.昆明医科大学 药学院暨云南省天然药物药理重点实验室，云南 昆明 650500；2.中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院药剂科，云南 昆明 650032；3.大理大学药学院，云南 大理 671003)

医院制剂是对药品市场的补充与完善，由医院制剂室依据制剂规范或处方来制备供医院临床使用而市场无销售的一种特殊制剂[1]，其特点是自配、自用、价廉，具有周期性并且药品的不良反应较少，费用低。医院制剂大多是基于中药处方，有散剂、膏剂、水丸、蜜丸等剂型，方便使用，更容易被患者接受[2]。

软膏剂携带方便，使用便捷，能够提高患者用药的依从性[3]。基质作为药材的载体，对药物有释药性，稳定性，透皮性[4]。复方紫云膏采用油性基质，性质稳定，不会易发生变质，涂布于皮肤上形成密闭的油膜，软化皮肤使其柔软，不易与水融合。此外软膏的质量标准也是一个值得探讨的问题，一般的软膏要考虑外观性状、延展性、稳定性、刺激性，但对于严重创伤或临床要求无菌的软膏需要进行无菌检查。

复方紫云膏又称紫草软膏，是一种中成药。在《外科正宗》[5]中有记载润肌膏，主要由麻油、紫草、当归组成，可用于养血、凉血、润燥，可治秃疮、白屑、头皮干枯瘙痒等症状。而该医院复方制剂的处方由紫草、白芷、冰片、蜂蜡、麻油组成，有清热解毒、凉血止痛的作用。用于I、II度烧伤、烫伤、湿疹、手足癣等症状[6-8]。其中紫草作为君药，含有大量的萘醌类色素和多糖类化合物，药用成分的萘醌类色素包括左旋紫草素、β，β-二甲基丙烯酞紫草素、紫草素、乙酰紫草素等[9-11]，具有活血消肿、去腐生肌、解毒透疹的作用，依据现在临床药理学研究，紫草的有效成分有抗炎止痛、抑菌抗病毒、抗肿瘤、免疫调节作用、护肝、促凝血以及抑制前列腺素合成等作用[12-14]，但目前临床上主要用于皮肤方面的疾病。白芷为臣药，根据所查文献白芷在复方制剂中主要是对湿热之症活血排污，治疗皮肤风邪湿热所引起的瘙痒[15]。冰片为使药，气清香，能透过皮肤屏障，使药物能够到达病症场所，发挥最大的药效。麻油和蜂蜡作为该处方中的油性基质，麻油具有生肌润肤，能缓解湿疹湿疮，富含维生素E，可抗氧化防治药液霉变；蜂蜡有一定的解毒作用，让膏体能在一定时间内快速定型，保持膏体的稳定性，对皮肤无刺激性[8，16，17，18]。

复方紫云膏中紫草的提取方法有很多，如醇提法、油炸法、油浸法、水煮法。本文所研究的提取方法就是采用油炸法[19]，方法简便快捷能满足医疗的需求。本文主要采用正交实验设计，以左旋紫草素含量为指标，优选出最佳的工艺方案来提高紫草素的含量，并对其软膏剂进行鉴别、含量测定、稳定性、均匀性、微生物限度检查[20-21]，保障质量，降低成本，提高收率。

1 试验材料

1.1 实验仪器

UV5紫外分光光度计(梅特勒托利多仪器(上海)有限公司)、KQ-50E型超声波清洗器(昆明市超声仪器有限公司)、DF-1012焦热式恒温加热磁力搅拌器(上海力辰邦西仪器科技有限公司)、温度计。BP121S型分析天平(梅特勒托利多仪器(上海)有限公司)、ME5502型天平(梅特勒托利多仪器(上海)有限公司)、HR30-IIA2型生物安全柜(青岛海尔特种电器有限公司)、JB-CJ-1000FC型洁净工作台(苏净集团安泰公司)、HPX-9082MBE型电热恒温培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)、MSL.N型压力蒸汽灭菌锅(威海威高海盛医用设备有限公司)。

1.2 试药和试液

紫草(批号：01-2130101，厂家：安徽芙蓉)；白芷(批号：01-21020102，厂家：安徽毫州)；冰片(批号：200612，厂家：云南林缘香料)；蜂蜡(批号：F210102，厂家：河北徐氏蜂蜡)；麻油(批号：20220323，厂家：云南华辉盛粮油)；左旋紫草对照品(批号：200405，厂家：中国药品生物制品检定研究院)；无水乙醇(批号：20220221，厂家：广东光华科技股份有限公司)；乙酸乙酯 (批号：1606101，厂家：上海申博化工有限公司)；石油醚(批号：200904，厂家：西陇科学股份有限公司)；香草醛(批号：C11695287，厂家：麦克林)；浓硫酸(批号：202101101，厂家：重庆川东化工)；氢氧化钠(批号：202101101，厂家：重庆川东化工)；盐酸(批号：202101101，厂家：重庆川东化工)；冰片对照品(批号：200303，厂家：中国药品生物制品检定研究院)；复方紫云膏(批号：220409、220410、220411)。

1.3 菌种

金黄色葡萄球菌(批号：G0042DX，厂家：广东黄凯微生物有限公司)、铜绿假单胞菌(批号：G0055DX，厂家：广东黄凯微生物有限公司)、大肠埃希菌(批号：G0039DX，厂家：广东黄凯微生物有限公司)。

1.4 培养基

胰酪大豆胨琼脂培养基(批号：1096841)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(批号：1105961)、胰酪大豆胨液体培养基(批号：1106141)、甘露醇氯化钠琼脂培养基(批号：1105961)、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基(批号：1081171)、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液(批号：317N031)，以上材料均来自广东黄凯微生物有限公司。培养基的适用性检查和控制菌检查的适用性符合2020版《中国药典》(四部)。

2 方法

2.1 现复方紫云膏制备工艺

将麻油升温至 120 ℃ 加入蜂蜡使其熔化，加入白芷，调至文火并维持此温度待至白芷焦黄，加入紫草，继续用维持微火加热，然后置于恒温箱中浸渍时间，趁热用四层纱布滤过，等冷却至 50 ℃ 左右，加入冰片搅拌至冷即可。

2.2 复方紫云膏中左旋紫草素含量测定

按照《中国药典》2020版一部中紫草项下含量测定，使用紫外分光光度计测定羟基萘醌总色素的含量，并以左旋紫草素记。

2.2.1 标准曲线的制备

精密称取左旋紫草素对照品 5 mg 置于 50 mL 容量瓶中，加入无水乙醇稀释定容，摇匀。分别取 1、2、3、4、5 mL 于 25 mL 的量瓶中，加无水乙醇稀释定容，摇匀。然后根据左旋紫草在 519 nm 处有紫外吸收，以无水乙醇作为空白对照，分别测定上述溶液的吸光度，并以吸光度为纵坐标，左旋紫草素浓度为横坐标绘制出标准曲线并考察线性关系。结果见图1。

图1 标准曲线

2.2.2 供试品溶液的制备

精密称定供试品 1 g，置于三角瓶中，精密量取无水乙醇 50 mL，超声溶解，在冰箱内冷藏过夜，摇匀，过滤，即得。

2.2.3 供试品的含量测定

照紫外分光光度法，在 519 nm 处测定供试品的吸光度，并将吸光度带入标准曲线内，计算出复方紫云膏的含量，按左旋紫草素(C16H16O5)的吸收系数(E1% 1 cm)为242计算。

2.2.4 复方紫云膏中紫草素的含量计算公式

平均含量=(C1+C2)÷2

2.3 单因素实验

根据处方先对文中的“文火微火维持此温度”进行试验，以110～90 ℃、120～90 ℃、130～90 ℃、140～90 ℃、150～90 ℃ 的起始温度作为考察，然后又对提取工艺中单因素进行研究：以提取温度(100、110、120、130、140 ℃)、提取时间(15、30、45、60、75、90 min)、 浸渍时间(0、6、12、18、24、30 h)分别进行实验，考察3个因素对复方紫云膏中左旋紫草素的含量影响。

2.4 正交实验

在单因素的基础上以提取温度、提取时间、浸渍时间为研究对象，拟定三因素三个水平，建立L9(34)的正交表，以9组提取条件进行实验，见表1。

表1 L9(34)正交实验水平表

3 实验结果与分析

3.1 标准曲线

以左旋紫草素对照品的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得回归方程式：y=0.0949x+0.0017，R2=0.9993线性关系较好，线性范围为：0.004～0.020 mg/mL，见图1。

3.2 单因素实验结果

3.2.1 提取温度对复方紫云膏中左旋紫草素的影响

根据处方提取温度条件进行试验，结果发现所测定的左旋紫草素的含量都没有达到规范所要求的含量。当温度为90～120 ℃ 时，含量是最高的但依旧没有到达 1.3 mg/g，结果如图2。

图2 提取温度(预实验)

通过查阅文献及预实验，重新设置温度。随着温度的升高，左旋紫草素含量逐渐的升高，在 130 ℃ 时含量达到最大值。但在 140 ℃ 以上随着温度的升高含量急剧降低，说明有效成份发生了改变，因此确定120～140 ℃ 作为设计水平，结果如图3。

图3 提取温度

3.2.2 提取时间对复方紫云膏中左旋紫草素的影响

当提取时间在30～90 min 的范围内左旋紫草素的含量高，结果如图4，因此确定此时间段作为正交试验分析的因素水平。

图4 提取时间

3.2.3 浸渍时间对复方紫云膏中左旋紫草素的影响

随着浸泽时间的增加，左旋紫草素的含量逐渐的增加，结果如图5，确定6～24 h 的浸泽范围为浸泽时间段进一步考察。

图5 浸渍时间

3.3 正交试验结果与方差分析

按照“1.5.1”和“1.5.2”中复方紫云膏的制备和测定方法，测定各项提取条件左旋紫草的含量，见表2。

表2 L(34)正交实验设计和结果

由正交实验表2知：从极差R可得出，影响复方紫云膏中左旋紫草素含量的主次因素为C>A>B，最佳的提取工艺方案是A2B2C3，即提取温度 130 ℃、提取时间 1 h、浸渍时间 24 h。是根据药学理论及经济学，为了节约时间和成本，在实际应用时浸渍时间可选用 12 h。从方差分析表3可知浸泽时间和提取温度的P<0.05，具有显著性，为主要的影响因素；提取时间的P>0.05，无显著性差异。

表3 方差分析表

3.4 验证实验

根据上述的提取条件，在洁净间平行进行三次验证性实验，按照紫外分光光度法，供试品溶液的制备：照“2.2.2”，供试品溶液的含量测定：照“2.2.3 ”进行测定，实验的结果如表4。

表4 验证实验结果

4 质量检验

4.1 检验项目

4.1.1 性状

本品为紫红色半固体，有清凉香气。

4.1.2 鉴别

紫草的鉴别 分别取三批样品约 2 g，加乙醇 5 mL，振摇，放置后液体显红色，加氢氧化钠试液5滴，液体变为蓝色，再加稀盐酸使溶液呈酸性后，液体由蓝变成红，本项结论3批样品中都含有紫草。

冰片的鉴别 分别取3批样品约 20 g，进行微晶升华，得到的白色升华物后，加无水乙醇 1 mL 使其溶解摇匀，作为供试品溶液。另精密称取冰片对照品 10 mg，加无水乙醇 1 mL 制成每 1 mL 含 10 mg 的溶液，作为对照品溶液。按薄层色谱法，用毛细管吸取上述两种溶液各 10 uL 分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-石油醚[沸程为60～90 ℃](2∶19)为展开剂，将薄层版放入展开缸中展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在 105 ℃ 加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，本项结论三批样品中都含有冰片。

4.1.3 含量测定

依据“3.3”的提取工艺条件，“2.1”制备方法制备3批药品，按2.2.3项分别测定含量，结果如表4，质量分数都大于1.3(mg/g)。本项结论三批样品符合质量要求。

4.2 微生物限度检查

4.2.1 微生物计数

1)实验准备：

培养基准备：按用量均以 121 ℃ 灭菌 15 min 备用。

试验材料准备：均以 121 ℃ 灭菌 30 min 备用。

2)供试液制备：

从样品中分别取 10 g，加入灭菌含 20 mL 的十四烷基异丙酯及玻璃珠的锥形瓶中，混匀，加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至 100 mL 制成1∶10的供试液。

3)计数方法：

平皿法中的倾注法

4)阴性对照：

用无菌的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液，照供试液同法进行操作，培养，计数。

5)净化工作台沉降菌动态检测：

将4个胰酪大豆胨琼脂平皿以无菌方式带入操作室，在操作台上下左右各放一个，在微生物限度检查的同时，打开盖子，放置后盖好皿盖，置30～35 ℃ 培养 48 h。统计平板上菌落数：上0个，左0个，下0个，右0个，平均0个。(应不超过1个)

6)表面微生物检测：

将4个胰酪大豆胨琼脂平皿以无菌方式带入操作室。待试验结束后，取2个琼脂平皿，在操作台左右各放一个，打开盖子，培养基表面与操作台直接接触，均匀按压接触碟底板，确保全部琼脂表面与取样点表面均匀充分接触，接触约 10 s，再将盖子盖上，置30～35 ℃ 培养 48 h。统计平板上菌落数：左0个，右0个，平均0个。(应不超过1个)

另取2个胰酪大豆胨琼脂平皿，打开盖子后，单手五指按压培养基表面，确保手与全部琼脂表面均匀充分接触 10 s，再盖上盖子，双手分别取后置置30～35 ℃ 培养 48 h。取出检查，统计平板上菌落数：左0个，右0个，平均0个。(应不超过1个)

本项结论洁净间的表面菌和沉降菌都符合要求。

7)培养与计数：

取上述供试液 1 mL 于无菌的平皿中，加入提前灭菌的胰酪大豆胨琼脂培养15～20 mL，混匀，置于 35 ℃ 的培养箱中培养 5 d，观察并计算菌落数。

取供试液 1 mL 于无菌平皿中，加入提前灭菌好的沙氏葡萄糖琼脂培养基15～20 mL，混匀凝固，置于 25 ℃ 的培养箱中培养 7 d，观察并计算菌落数。

另外取上述“(4)”阴性对照液同上述操作。结果见表5。

表5 微生物计数实验结果

4.2.2 控制菌检验方法

根据《中国药典》2020版四部通则1107规定，皮肤给药制剂不得检测出金色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。

1)阳性对照组：

35 ℃ 连续培养 22 h 的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液制备成每 1 mL 含菌量不大于100cfu的菌液。取上述菌液 1 mL 加入 9 mL pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中混匀后加入 100 mL 的胰酪大豆胨液体培养基在 35 ℃ 中培养18～24 h。

2)供试液组：

取“上述2.1.5.1中(2)”的溶液 10 mL，加入胰酪大豆胨液体培养基至 100 mL，制成1∶10供试液。

3)阴性对照组：

用稀释液代替菌液进行制备方法同上。

4)增菌培养：

过程见表6。P(5)选择和分离培养

表6 增菌培养

金色葡萄球菌：取上述增菌液划线接种到甘露醇氯化钠琼脂培养基，在 35 ℃ 的培养基中培养 24 h，观察并判断菌种。

铜绿假单胞菌：取上述增菌液划线并接种到溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基，在 35 ℃ 的培养基中培养 24 h，观察并判断菌种。结果见表7。

表7 控菌检查结果

由上可得3批复方紫云膏符合要求。

4.3 装量差异

药品在进行质量检验的过程中也包括重量差异，该复方制剂采用的是最低装量检验法，结果见表8。

表8 装量差异

本项结论三批药品的装量都大于95%，符合规定。(2020版中国药典(四部)通则∶至 50 g 规定不少于标示的95%)

5 讨论

该医院制剂复方紫云膏采用了较为传统的油炸法进行提取，虽然增加了药物脂溶性成分的溶出，在临床上取得了较好的疗效。但是存在着油炸的过程温度较高的问题，使制备过程中不稳定性因素增多，不容易控制。紫草作为主药，有效成分会随着油温的增加而减少，尤其实在 140 ℃ 以上，左旋紫草的含量减少至55%。本实验对该复方制剂的提取工艺进行优化，减少有效成分的损失。最后实验结果显示最佳的提取工艺为提取温度 130 ℃，提取时间为 30 min，浸渍时间为 24 h，然后根据此工艺条件，平行制备3批，对工艺进行验证后，表明提取工艺稳定性优良，可行性高，重复性好，符合医院制剂复方紫云膏的质量要求，可以为其生产提供参考。

此外质量检验在医院制剂中仍然是非常值得关注的问题，医院制剂有其特殊性，是药品生产企业无法代替的。为保证自制制剂的质量，加强检验是有效的手段之一[22]。