经血源性子宫内膜间充质干细胞的分离、体外扩增及形态学特点

摘要：目的 从妇女经血来源的子宫内膜间充质干细胞（MenSSCs）中获得一种具有特殊生物学特性的细胞。方法 用 Percoll浓度梯度离心法对大鼠月经血进行了分离和传代培养；免疫荧光法测定培养细胞Vimentin的表达情况，鉴定细胞来源；应用流式细胞术测定 MSCs表面标志物CD90、CD146的表达。结果 利用 Percoll浓度梯度离心法，可使妇女经期血液中的原代细胞呈漩涡状、放射状或集落状；增殖快，传代周期约7～8 d；结果表明，经传代培养，其增殖速度较快，且主要为成纤维细胞。经免疫荧光法鉴定，该细胞为 Vimentin （vimentin）表达的间质细胞。流式细胞术分析的结果表明，在传代培养的第1代和第3代细胞中，CD90和CD146拥有较高的表达，CD146也有较低的表达。第三代细胞CD146的表达率高于第一代細胞。结论 从月经血中分离培养的细胞来源于间质；具有干细胞特性：具有高度增殖能力，表达间充质干细胞标记物；用传代法对细胞进行提纯。

关键词：血源性；干细胞；传代培养；鉴定

干细胞由于具有细胞保护、再生和免疫调节能力备受关注[1]。成体干细胞在目前的研究中是首选，这些未成熟的干细胞在进入临床之前，还要面临致畸、伦理问题、高成本和低效率等问题。目前，源自骨髓和脐带血的细胞已经成为细胞疗法。后来开始研究一些更容易获得的组织来源，主要是一次性组织，如胎盘、羊水、羊膜、脐带组织、牙髓和脂肪组织等[2]。由于间充质细胞具有良好的体内修复能力，已被更广泛地研究。间充质细胞不自主表达MHC-II分子，具有低免疫原性和耐受能力，因此它们已经被研究为治疗自身免疫性疾病、炎症性疾病和退行性疾病的工具。连续的研究报告了不同来源的间充质细胞，可能或多或少适合于特定疾病的治疗[3～4]。

从妇女经期血液进行分离和纯化，其对形态学和生长特性进行了观察，并对其进行了体外扩增，并通过免疫荧光及流式细胞分析技术鉴定细胞来源，以及分析间充质干细胞表面标记物（CD90、CD146）的表达情况，可以为科研或单位在 MenSCs细胞制品的制作过程中提供借鉴。

1材料及方法

1.1 材料来源

1.1.1 研究对象

选取月经规律的育龄期健康女性30名为研究对象。排除标准：近6个月内使用性激素或宫内放置节育器者；异常有子宫出血的症状，或者是有其他的妇科疾病，比如子宫腺肌症、子宫肌瘤、子宫内膜息肉等。所有受试者都已知晓并签字，经医院伦理委员会审核通过。

1.1.2 细胞获取与处理

在捐助者经期第2～3天采集5～10 ml的经血，将这些细胞转移到了含有青霉素/链霉素（1%）的 PBS缓冲液中，24 h之内将样品运输到了实验室，在运输到实验室之前，这些样品应该放在4℃的环境下进行存储。

1.2 细胞分离及培养

1.2.1 细胞分离

在实验室取出存储的经血样本5 ml，以等量的消毒PBS-缓冲剂稀释，搅拌，转速1500 r/min，冲洗5 min，重复2次，去掉上层清液，加3 ml完整的培养基重新悬浮，3 ml的淋巴细胞分离物 Percoll在另一根离心管内，3 ml的细胞悬浮物慢慢地加到Percoll上。注意不要损坏细胞悬液-培养基的分界面，于室温下以1800 r/ min的速度离心25 min，在离心完毕后，将Percoll和介质间所形成的白色薄膜取出，并转移到一个新的离心管内。用3 mlPBS-缓冲剂使细胞重新悬浮，然后在室温下以1500 r/ min的速度离心5 min，反复清洗，将上层清液完全除去。用DMEM/F12完全培养基（10%（V/V）FBS，1%双抗（青霉素/链霉素）重新悬浮，计数，调节到合适的浓度，然后将其接种在涂有 FN纤维连接蛋白的玻璃瓶中，放入5%CO2培养箱，37 ℃。每隔24 h用显微镜观察细胞的粘附和生长。每隔72 h更换一种新的培养基，将没有贴壁的细胞剔除，每隔3～4 d更换一次新的培养基。

1.2.2 细胞传代培养

等瓶子里的纺锤体细胞融合率达到80%～90%时进行传代。加入0.25%胰蛋白酶，将其放到37℃、5%CO2培养箱，进行2 min的消化。在显微镜下对其进行观察，可以看到贴壁细胞间隙逐渐增大，细胞逐渐变圆，并有部分细胞已从培养瓶上脱落。将培养瓶置再次放置培养箱内继续消化2 min，如此反复，直至有90%以上的粘附细胞脱离。通过添加等体积的完整培养基来结束该消化，并以1000 r/ min的速度将细胞悬浮液移走离心5 min。取上清液，以2 ml纯正培养液对试管进行重新悬浮，并调节其浓度，以1：2的比例接种于试管内。

1.3 统计学处理

数据处理采用SPSS 22.0统计学软件，计量资料以（±s）表示，采用ｔ检验，计数资料用比率表示，采用χ2检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1 细胞的形态学特点

细胞接种培养24 h后，在倒置显微镜下观察到细胞开始出现了平铺性的贴壁生长，其形状为梭形或多边形，具有明显的轮廓，混有少量圆形的红细胞（图1a）。每天在显微镜下，对细胞的生长状况进行观察，每3 d换液一次，将未贴壁的细胞及杂质剔除掉。第3天可以看到部分细胞出现集落状生长，集落大小和分布都不均匀（图1 b）。大约培养7 d后，可以看到约80%的细胞融合（图1 c）。15 d后，细胞聚集在一起，形成了一个漩涡，放射状的群落（图1 d）。

当融合率达80%时开始传代，传代时间为7～8 d。随着代数的增加，大多数杂质可被去除，并且细胞形态逐渐趋于同类化（图2a～b）。

2.2 免疫荧光染色法观察细胞Vimentin的表达

Vimentin（波形蛋白）是一种III型中间丝蛋白，是间充质细胞的标记物。用免疫荧光法对一、三代培养的细胞进行染色，结果显示Vimentin在细胞中的表达呈阳性： Vimentin用 DAPI标记的细胞骨架显示出绿光，用来标记的细胞核显示出蓝光，可观察到细胞的形态呈扁平的梭形或多边形。确认作为间质细胞的培养细胞源（图3 a～b）。对照组结果为阴性。

2.3 流式细胞分析检测细胞中CD90及CD146的表达情况

对培养的第1代和第3代细胞进行流式细胞分析，结果显示CD90在细胞中呈高表达，CD146呈低表达。CD90的阳性表达率在第1代和第3代细胞中分别为54.3%和47.3%，没有统计学差异（P=0.918）。CD146的阳性表达率在第1代和第3代細胞中分别为0.29%和4.27%，有显著统计学差异（P＜0.0001）（图4～5）。

3讨论

子宫厚度可以影响到胚胎的发育，8～14 mm的子宫内膜厚度可以极大地促进胚胎发育，从而为其发育提供良好的环境。机械性损伤、服用药物以及年龄增长，导致子宫内膜变得较薄的情况非常普遍，子宫内膜薄不利于孕卵的着床。随着时代的进步，晚婚晚育的情况变得日益普及，这就使得由于年龄而引起的子宫内膜薄的情况变得更加严重。由于多种原因，子宫内膜的细胞增殖受到了严重的阻碍，从而导致其发育受到限制。目前，治疗薄型子宫内膜（TE）的主要方法是采用药物治疗，其中包括使用雌激素、阿司匹林和枸橼酸西地那非等药物。除了传统的血浆、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）以及骨盆底神经肌肉电刺激（NMES），现在也提供了多种治疗方案满足患者的不同需求。

近年来，“万能细胞”的发现极大地推动了干细胞自我更新和多向分化的发展，这一发展趋势也引起了学术界的广泛关注，尤其是在薄型子宫内膜研究方面，这一课题受到了极大的重视。本研究利用密度梯度离心方法进行筛选，可以除去大多数的红血球，从而达到初步纯化的目的。在此基础上，对原代细胞进行分离培养，利用Percoll初步分离月经血，观察原代培养的细胞，仅存有少量红细胞杂质。FN是一种细胞培养液，它可以促进细胞的贴壁率超过90%，还可以提高细胞的成活率，缩短生长周期。此外，在本试验中，所用的试管都涂有纤维连接蛋白，这也是决定试管能否成功的重要原因。

参考文献

[1] 彭艳.经血源性子宫内膜间充质干细胞体外分离培养及初步鉴定[D].哈尔滨：哈尔滨医科大学，2023

[2] 李华，李晓帆，李乃农.间充质干细胞促进脐带血干细胞体外扩增的研究进展[J].中华细胞与干细胞杂志，2022， 12（1）：34-38.

[3] 闫岩.Ⅱ型糖尿病大鼠模型的建立与评价及经血源性子宫内膜干细胞的分离方法优化[D].新乡：新乡医学院，2018.

[4] 周云帆，杨波，胡祥等.经血源性子宫内膜间充质干细胞的分离、培养与鉴定[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14（32）：5952-5956.