鹿血生物活性肽体外抗菌研究

◎ 付 慧，李红莹，高倩倩

(吉林农业科技学院食品工程学院，吉林 吉林 132000)

1 前言

生物活性肽是一类对动植物机体的生理活动有益的肽类化合物，被广泛应用在食品及药品等领域，其他领域还有待开发[1]。一直以来，在人的认知当中，鹿血都具有非常神奇的功效，它不仅可以益寿延年、活筋健骨、缓解疲劳，而且能够提高机体免疫力，抵抗疾病入侵。微量元素、维生素是人体不可或缺的成分，而鹿血当中恰恰蕴含着丰富的对人体有益处的微量元素，如氨基酸、多肽、血红蛋白等[2]。其中，血红蛋白是大分子化合物，人体无法对其直接吸收利用，小分子的多肽则可以。鹿血制备的生物活性肽对人体有益的优点有很多，比如可以降胆固醇和血压、调节免疫力和肠道菌群，保护心脑血管，还具有抗氧化作用[3-4]。随着科学技术的飞速发展，现如今，利用酶解技术可以将鹿血水解成小分子的生物活性肽，其具有抗炎抗菌、抗癌降压、治疗骨质疏松等功效[5]。

本试验通过药敏纸片法和MIC 法，测定鹿血生物活性肽抗菌效果，结果表明，生物活性肽对抑制菌群生长具有非常显著的效果。因此，为充分挖掘生物活性肽的抑菌活性，对其进行深入性研究势在必行。目前，我国研究生物活性肽的动物血液种类有很多，最为常见的是羊血和驴血。但是对鹿血中的生物活性肽的研究则少之又少，其体系也差强人意[6]。希望通过本次试验，能够突破对鹿血生物活性肽的研究，促进鹿血生物活性肽的进一步发展，以创造更多的市场。

2 材料和方法

2.1 试验材料

鹿血生物活性肽纯化液：前期研究成果；大肠杆菌与金黄色葡萄球菌以及枯草芽孢杆菌：实验室冰箱保存；牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、1 mo1/L Na0H 溶液、1 mo1/L HC1 溶液、胰蛋白胨、乳糖、K2HPO4、KH2PO4、三号胆盐；硫酸纸、烧杯、乳糖胆管、三角瓶、吸量管、培养皿、玻璃棒、报纸、棉线、酒精灯、煮锅、接种针、涂布棒、游标卡尺、麦氏比浊管、96 孔板。以上菌种、药品及小件物品，均由食品工程学院微生物实验室提供。

2.2 主要仪器

ZY-75MA 型高压蒸汽灭菌锅:浙江新丰医疗器械有限公司；JC-100A 型生化培养箱：青岛诚瑞信德环境科技有限公司；JA2003 型分析天平：上海析牛莱伯仪器有限公司；10-100 μL 移液枪:南京烔创科技有限公司；C21-QH2133 型电磁炉：浙江苏泊尔股份有限公司；PB-10 型酸度计：金博仕生物技术有限公司；GB/T17623 全自动多功能振荡仪：得利特科技有限公司。

3 试验方法

3.1 基础培养基的制备

3.1.1 操作流程

药品称量→溶解→加琼脂融化→调pH 值→分装→包扎标记→灭菌→摆斜面或倒平板→无菌检查

3.1.2 操作步骤

①药品称量：称取牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、琼脂30 g，放到硫酸纸上备用。②溶解：用量简取1 L 蒸馏水倒入煮锅中，在电磁炉上小火加热，添加药品顺序为牛肉膏、蛋白胨和氯化钠，并用玻璃棒搅拌均匀，以防液体溢出或烧焦，直至药品完全溶解。③融化琼脂:琼脂在95 ℃融化，40 ℃凝固，所以向溶液中加琼脂要一边搅拌一边分多次加入，直至琼脂完全溶化变粘稠并且无颗粒，停止加热，补足蒸发的水分（水需预热）。④调节pH:根据培养基对pH 的要求，用1 mo1/L Na0H和1 mo1/L HC1溶液调节pH至7.2～7.4。用酸度计测定溶液pH 值。⑤分装：根据需要分装入试管或三角瓶。分装量要均匀一致，试管一般为高度的1/5-1/4，三角瓶一般为其体积的1/3-1/2 为宜。⑥包扎、记号:分装后的试管配好棉塞，7 支试管为一组，包上报纸，用棉绳系好，并标明培养基名称及日期。⑦灭菌：将所有需要灭菌的物品放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌(121 ℃，20 min)。⑧摆斜面、倒平板：摆斜面时注意斜面的长度不要超过试管总长的1/2-2/3，趁热倒平板，倒入培养基的量约为15 mL 左右，盖上上盖后轻轻晃动，使培养基在培养皿底部分布均匀，凝固之后成为平板，并贴好标签，标明培养基名称。此步需在无菌条件下操作。⑨无菌检查:将平板倒置放入恒温培养箱中培养，温度设置为37 ℃，培养24 h，检查灭菌是否彻底，无杂菌生成，冷却保藏备用。

3.2 菌种活化

3.2.1 操作流程

灭菌操作→分离培养→LB 培养基配制→灭菌→扩大培养→保存

3.2.2 操作步骤

①操作前准备。将接种针、酒精灯、打火机、无菌平板、酒精棉球、镊子、洁净烧杯、平板和斜面培养基、菌种等，置于超净工作台，打开紫外灯，灭菌20 min。点燃酒精灯,用镊子取酒精棉球擦拭双手和台面。②斜面接种、平板划线分离。菌种管在前，接种管在后，斜面向上管口对齐，斜持呈45°角，将灼烧灭菌的接种针插入菌种管内，先与无菌落生长培养基接触，冷却后，从斜面刮取少量细菌苔，迅速插入接种管。在试管中从下向上做S 形划线。接种后，立即塞上棉塞，再次灼烧接种环并将其恢复到原来的位置。按种管贴好标签后放入试管架，即可进行培养。在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种针，挑取菌苔在平板上Z 字形划线，其目的是通过划线将样品在平板上进行稀释分离，获得足够的单个菌落。划线完毕后，盖上培养皿盖，封口膜封口。37 ℃倒置培养。③LB培养基的配制。成分：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，加蒸馏水至1 000 mL，调pH 至7.2，分装至50 mL 锥形瓶中，制备150 mL 液体培养基，121 ℃灭菌20 min。④扩大培养。用接种针挑平板内单个菌落（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌），移至LB 培养液中，在振荡器内220 rmp/min 振荡12 h,使细菌分散在培养液中。培养后的菌液放置于4 ℃冰箱保存,不超过一周，为接下来实验做准备。

3.3 抑菌圈直径的测定

本试验供样菌分别为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草亚芽孢杆菌，并且通过药敏纸片法来推断出鹿血生物活性肽的抗菌效果[7]。用打孔器在定性滤纸上面打出6 mm圆片若干个，用于浸蘸不同浓度的生物活性肽溶液。取鹿血生物活性肽纯化溶液33 mL 和五支20 mL 比色管，将33 mL 鹿血生物活性肽纯化溶液配成不同浓度梯度（0.0、0.05、0.25、0.35、0.45、0.55 mg/mL）的六个样品溶液。方法如下：在第一支比色管中加入鹿血生物活性肽纯化溶液1 mL；在第二支比色管中加入活性肽纯化液5 mL；在第三支比色管中加入活性肽纯化液7 mL；在第四支比色管中加入活性肽纯化液9 mL；在第五支比色管中加入活性肽纯化液11 mL。再向这五支比色管中分别加入蒸馏水进行稀释，稀释至比色管20 mL 刻度线处。第六支比色管中不加样品，加入无菌水至20 mL 刻度线处即可，作为空白对照组。

用无菌涂布棒轻轻蘸取三种菌液少量多次均匀涂抹在固体培养基表面，再用无菌镊子轻轻夹取6 mm滤纸片浸入不同浓度稀释液试管中，使滤纸片完全浸在试管内至少10 s，滤纸片应全部浸有溶液以便保证试验的准确性。每个菌液培养基中放入不同浓度的三片滤纸片，且均匀分布在培养基内。整个实验操作均在超净工作台中进行，重复试验3 次后，将平板倒置在生化培养箱中37 ℃条件下培养24 h。接着，观察抑菌结果，并用游标卡尺测量抑菌圈大小。

3.4 最低抑菌浓度的测定

3.4.1 EC 肉汤的制备

成分组成：胰蛋白胨20 g/L、乳糖5 g/L、氯化钠5 g/L、磷酸二氢钾1.5 g/L、磷酸氢二钾4 g/L、三号胆盐1.5 g/L。

3.4.2 分光光度法测定菌液OD 值

本试验选用上述实验室活化好的大肠杆菌，金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌。用接种环挑取单个菌落于灭菌后的试管内，加入生理盐水进行稀释，稀释至与0.5 麦氏比浊管浑浊程度相同，其作为后面所需的菌悬液。配置好的菌悬液置于振荡器振荡内，220 rmp/min 振荡12 h。然后，将这三种菌悬液分别倒入三支分光光度计比色管内，波长固定在515 nm 处，分别测量出三种菌悬液的OD 值。

3.4.3 最小抑菌浓度测定步骤

方法采用微量肉汤二倍稀释法[8]，测定鹿血生物活性肽对三种细菌的最小抑菌浓度。在超净台内操作，所用仪器均已完全消毒，取96 孔细菌培养板留34 孔作为接下来的试验，该产品是以伽玛射线灭菌处理后的，无需再次灭菌。大肠杆菌（A）、金黄色葡萄球菌（B）、枯草芽孢杆菌（C）各11 孔，共A、B、C 三排。在细菌培养板第一排（A）1 到11 孔内用量程最大为100 μL 的移液枪分别加入100 μL EC 肉汤，再向第1 孔中加100 μL 生物活性肽原溶液，浓度为512 μg/mL,用枪头混匀，然后从1孔内吸取100 μL至第2 孔混匀，混匀后吸取100 μL 至第3 孔，以此连续倍比稀释至第11 孔，从第11 孔混匀后吸取100 μL弃去，此时，每孔溶液浓度依次为：256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL。然后在1 到11 孔依次添加浓度为1×108 CFU/mL 的菌悬液，剩下两排均重复上述操作。另取一孔只加100 μL EC 肉汤和100 μL浓度为1×108 CFU/mL 菌悬液作为空白对照。以上操作结束后，将96 孔细菌培养板用保鲜膜盖住防止液体蒸干，置于恒温培养箱中37 ℃恒温培养18 h，观察细菌生长情况。

4 结果与讨论

本次实验测定了不同浓度的鹿血生物活性肽溶液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌三种细菌的抑菌效果，结果如表1、表2 所示。

表1 生物活性肽纯化液对3 种细菌的抑菌效果表

由表1 可知，当鹿血生物活性肽浓度低于0.25 mg/mL 时，对3 种细菌的生长均无抑制效果；当鹿血生物活性肽浓度在0.35～0.55 mg/mL 时，对3 种细菌均有较强的抑制效果。通过观察发现，在鹿血生物肽浓度为0.55 mg/mL 时，各菌种的抑菌圈最大。通过游标卡尺测定，实验中大肠杆菌的最大抑菌圈直径为20 mm，金黄色葡萄球菌的最大抑菌圈直径为18.30 mm，枯草芽孢杆菌的最大抑菌圈直径为19.50 mm。即实验所用鹿血活性肽在0.55 mg/mL 浓度下抑菌效果最佳，对大肠杆菌的生长抑制作用最强。

3 种菌悬液的OD 值分别为0.65、0.08、0.11。鹿血生物活性肽对3 种菌的最小浓度测定结果如下：大肠杆菌所测得的最小浓度为0.52 mg/mL，金黄色葡萄球菌的最小浓度为0.97 mg/mL，枯草芽孢杆菌最小浓度为1.36 mg/mL。

5 结语

在一定浓度范围内，鹿血生物活性肽抑菌效果随其浓度含量的增大而增强。最小抑菌浓度为0.52 mg/mL，抑菌强度顺序依次为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌。当鹿血生物活性肽浓度为0.55 mg/mL 时，培养基中大肠杆菌的抑菌圈最大，其直径为20.00 mm，即本实验中所用的鹿血生物活性肽溶液在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌3 种细菌中，对大肠杆菌的生长抑制效果最强。