miR-361-3P调控转化生长因子β1诱导成骨细胞凋亡的研究

王帆，王鹏皓

（中国医科大学附属第一医院骨科，沈阳 110001）

人体骨骼的正常代谢依靠成骨细胞与破骨细胞的动态平衡维持。这种动态平衡受骨组织周围微环境中存在的多种细胞因子调节，其中，转化生长因子β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1） 作为骨组织局部微环境中至关重要的调节因子，在成骨活动中发挥十分重要的作用［1］。细胞凋亡使细胞在基因控制下程序性死亡，进而维持体内细胞数量动态平衡，影响组织周围内环境相对稳定。研究［2］证明，微RNA （micro RNA，miRNA） 对成骨细胞的再生、转化、分化等代谢过程起至关重要的作用。目前对miR-361-3P在骨代谢相关疾病中的研究较少见，且其对成骨细胞自我程序性死亡的作用机制尚未清楚。因此，本研究拟通过分子生物学技术检测人成骨细胞内miR-361-3P对TGF-β1和细胞凋亡标志分子caspase 3蛋白活性表达的影响，以探讨miR-361-3P/TGF-β1通路在人成骨细胞凋亡中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

用DMEM培养液 （含10 % 胎牛血清、300 mg/L G418） 于37 ℃、5% CO2培养箱中培养人成骨细胞系hFob1.19 （北京307-青藤转化医学中心）。

1.2 细胞分组及转染

miR-361-3p mimic （mimic）、miR-361-3p inhibitor（inhibitor） 和 TGF-β1 siRNA （si-TGF-β1） 均购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司。将hFob1.19细胞随机分为control组、mimic组及其阴性对照组 （mimic-NC组）、inhibitor 组及其阴性对照组 （inhibitor-NC组）、si-TGF-β1及其阴性对照组 （si-NC组）。采用Lipofectamine 2000脂质体转染系统 （北京中杉金桥生物有限公司），于37 ℃、5% CO2、95%湿度条件下行细胞转染8 h。

1.3 CCK-8实验

将hFob1.19细胞转移至6孔板，培养48 h，每孔加入10 μL CCK-8 （5 mg/mL，北京中杉金桥生物有限公司），孵育2 h，450 nm 处检测吸光度。

1.4 实时PCR （real-time quantitative PCR，RT-qPCR）

用TRIzol试剂提取细胞总RNA。采用Nanodrop 2000测定RNA样品的浓度和纯度。用primematipt混合RT 随机引物对mRNA行逆转录。用TRIzol reagent行miRNA逆转录。采用PrimeScript RT Master Mix及ABI Prism7500序列检测系统进行cDNA扩增。以GAPDH和U6作内参照。采用2-ΔΔCt法分析miRNA和mRNA的相对表达量。采用不同引物检测环状RNA的后剪接，采用聚合引物检测线性mRNA。miRNA和mRNA引物见表1。

表1 miRNA和mRNA引物设计 （5’-3’）Tab.1 Primer design for the miRNA and mRNA expression assays （5’-3’）

1.5 Western blotting

采用放射免疫沉淀法提取细胞总蛋白，用8%或10% SDS-PAGE分离后，转移至PVDF膜。加入TGF-β1一抗（稀释1 ∶250，美国赛默飞公司），37 ℃孵育过夜。用PBS洗膜后，加入过氧化物酶偶联的二抗 （美国赛默飞公司），37 ℃孵育2 h。PBS洗膜，采用增强化学发光法显色。用GAPDH （稀释1 ∶2 500） 作内参照。

1.6 报告基因荧光素酶活性测定

将miR-361-3p和TGF-β1的3’-UTR插入pmirGLO质粒，获得荧光素酶报告载体 （pmirGLO-miR-361-3p-wt，pmirGLO，TGF-β1-wt）。构建突变质粒 （pmirGLOmiR-361-3p-mut和pmirGLO-TGF-β1-mut）。96孔板中培养hFob1.19细胞24 h，分别转染上述pmirGLO质粒48 h，使用双荧光素酶报告基因检测系统 （美国Promega公司） 测定荧光素酶活性。

1.7 统计学分析

采用Prism7.0软件进行统计学分析。计量资料以±s表示。采用Shapiro-Wilk检验分析数据分布，Levene检验分析方差齐。采用未配对的Student’st检验 （正态分布和方差齐数据）、Welcht检验 （方差不齐数据） 或Mann-WhitneyU检验 （非正态分布数据） 进行组间比较。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-361-3p对成骨细胞内TGF-β1的调节作用

miR-361-3p mimic作用成骨细胞48 h后，细胞内miR-361-3p mRNA表达水平明显升高 （图1A），TGF-β1mRNA表达水平显著下调，TGF-β1蛋白表达水平受到明显抑制 （图1B、1C），差异均有统计学意义 （P＜ 0.05）。

图1 miR-361-3p 对成骨细胞内TGF-β1表达的影响Fig.1 Effects of miR-361-3p on TGF-β1 expression in osteoblasts

2.2 miR-361-3p对成骨细胞增殖及凋亡的影响

miR-361-3p mimic作用成骨细胞48 h后，CCK-8结果显示细胞增殖被显著抑制 （图2A）；同时，酶联免疫吸附实验和Western blotting均发现，成骨细胞内caspase 3蛋白表达水平明显升高 （图 2B、2C），差异均有统计学意义 （均P＜ 0.05）。

图2 miR-361-3p对成骨细胞增殖及caspase 3 活性的调控作用Fig.2 Regulation of miR-361-3p on osteoblast proliferation and caspase 3 activity

2.3 miR-361-3p负向调控靶基因TGF-β1对成骨细胞增殖和凋亡的影响

miR-361-3p与TGF-β1mRNA的3’-UTR区域存在多个结合位点 （图3A）。荧光素酶报告基因实验显示，miR-361-3p mimic组中 WT-TGF-β1的荧光素酶活性明显降低 （图3B），证实miR-361-3p可与TGF-β1mRNA结合并干预其表达；与control组和inhibitor-NC组比较，miR-361-3p inhibitor可明显抑制成骨细胞内miR-361-3p mRNA的表达和caspase 3的蛋白活性 （图 3C、3F），显著增强成骨细胞增殖效应 （图3E）；si-TGF-β1可显著抑制成骨细胞增殖，而显著增强caspase 3的蛋白活性 （图3D、3F），差异均有统计学意义 （均P＜0.05）。以上均证实miR-361-3p/TGF-β1对成骨细胞增殖和凋亡具有调控作用。

图3 miR-361-3p/TGF-β1调控成骨细胞增殖和凋亡的作用Fig.3 Role of miR-361-3p/TGF-β1 in regulating osteoblast proliferation and apoptosis

3 讨论

miRNA是基因表达调控的重要组成部分，通常由20～24个核苷酸组成，通过多种途径 （包括直接抑制翻译过程，或通过烯基化使mRNA靶点降解） 参与细胞增殖、凋亡、迁移等过程及炎症、感染、固有免疫的调控，在机体的免疫应答、肿瘤发生发展等方面发挥重要作用［3］。近年来，miRNA对骨代谢的影响受到广泛关注。研究表明，miR-150-3p 通过β-catenin对间充质干细胞的成骨分化产生影响［4］；miR-23b通过影响Smad3抑制MC3T3-E1细胞的成骨化［5］；miR-103a通过在转录过程后调控Runx2，抑制成骨细胞的活性，从而降低细胞外基质的矿化［6］；miR-204和miR-211通过抑制Runx2蛋白在成骨活动中的负反馈调节，增加人骨髓间充质干细胞内的脂肪生成［7］。本研究结果显示，miR-361-3p可能通过抑制靶基因TGF-β1的转录和蛋白活性，抑制成骨细胞的增殖，并促进成骨细胞凋亡。

miRNA通过与靶基因相关序列位点结合发挥作用。此序列通常仅包含6～8个碱基，因此，1个miRNA可能对多个mRNA产生作用，而1个 mRNA可能受多个miRNA调控［8］。某些miRNA的缺失可能不会影响机体正常的生长发育，但可能引发疾病，很多慢性疾病的发生均与miRNA特殊的作用方式有关。miR-361-3p作为一种抗炎mi-RNA，可通过靶向抑制活化性T淋巴细胞核因子5调节核因子κB［9］；miR-361-3p在肺组织中存在表达，通过抑制癌细胞的生成、转移，加速癌细胞的凋亡，发挥抗癌的功能［10］；miR-361-3p过量表达可抑制高糖环境下的肾小管上皮细胞凋亡，降低乳酸脱氢酶含量，提高肾小管上皮细胞存活率，降低细胞内丙二醛和caspase 3 的表达水平［11］。miR-361-3p能调控多种靶基因，如胰岛素样生长因子1、TNF、p73和促卵泡激素等［12］。本研究表明，人成骨细胞内的miR-361-3P与靶基因TGF-β1的启动区有8个碱基结合位点，可靶向抑制TGF-β1基因转录，参与成骨细胞凋亡。

TGF-β1具有多效性及多向性，通过自分泌或旁分泌等方式与细胞表面受体信号结合，调节细胞增殖、分化及凋亡。研究［13］表明，TGF-β1对心肌细胞增殖、凋亡及成纤维化等有调控作用；TGF-β1高表达通过旁分泌机制使心脏成纤维细胞的胶原形成增加，导致心肌肥厚、心肌收缩功能降低［14］。骨组织微环境中，TGF-β1由成骨细胞产生，通过控制成骨细胞调节骨代谢活动，在骨组织形成和骨组织吸收的动态平衡中发挥至关重要的作用。对小鼠成骨细胞的研究发现，TGF-β1可通过降低RANKL、增加OPG的表达，减少破骨细胞的生成和骨吸收降低［15］。本研究通过检测凋亡蛋白caspase 3的活性表达，探讨miR-361-3p/TGF-β1和成骨细胞凋亡间可能存在的相关性。结果发现，当阻断miR-361-3p/TGF-β1通路时，成骨细胞凋亡和caspase 3蛋白活性明显增强，表明miR-361-3p/TGF-β1可负向调控成骨细胞的凋亡。

综上所述，本研究探讨了miR-361-3p通过TGF-β1影响成骨细胞增殖及凋亡的作用机制，发现TGF-β1是miR-361-3p的靶基因，且miR-361-3p通过下调TGF-β1的表达，促进成骨细胞增殖，抑制成骨细胞凋亡。