西瓜甜瓜品种（系）苗期枯萎病、蔓枯病抗性快速联合鉴定技术

姚协丰 徐建 朱凌丽 娄丽娜 刘广 张曼 侯茜 徐锦华 羊杏平

摘 要：西甜瓜枯萎病、蔓枯病是设施生产中的防治难点，培育及推广优质复合抗病新品种是生产上控制病害最为经济、环保、有效的手段。开展复合抗性育种研究，品种资源的复合抗病性鉴定是首要工作。但是目前尚无两种病害抗性鉴定技术标准发布，为了提高品种资源复合抗性鉴定的效率、准确性、规范性，对枯萎病、蔓枯病病原菌的来源与扩繁，苗期活体接种和离体叶片接种结合方法，联合抗病鉴定评价指标等进行技术总结，以规范西甜瓜品种（系）苗期抗枯萎病、蔓枯病的快速联合鉴定技术方案。本研究方案克服了“以往单一接种效率低、周期长、耗费多，避免了传统活体先后接种方法病害发病交互影响，病情指数偏高，易产生误导性结果”等缺点，为大批量初步筛选西瓜甜瓜枯萎病、蔓枯病复合抗性品种资源提供可参考的技术方法。为推动西甜瓜抗枯萎病、蔓枯病育种和种业提升提供技术保障。

关键词：西瓜；甜瓜；枯萎病；蔓枯病；联合抗性鉴定

基金项目：江苏省重点研发计划项目[BE2021364]；江苏省种业振兴揭榜挂帅项目[JBGS（2021）075，JBGS（2021）069]；国家西甜瓜产业技术体系项目（CARS-26-08）。

作者简介：

姚协丰（1982-），男，江苏苏州人，博士，副研究员，主要从事西瓜甜瓜抗病育种与技术推广。  E-mail：yaoxiefeng@jaas.ac.cn

*通信作者：徐锦华，男，研究员，主要从事西瓜甜瓜育种。

E-mail：jinhuaxu@jaas.ac.cn。

西瓜、甜瓜是重要的园艺经济作物，在我国蔬果生产、消费中占据了十分重要地位，在调整农业产业结构和促进农民增收致富等方面发挥显著作用[1-2]。随着西甜瓜设施栽培面积的不断扩大及种植年限不断增长，西甜瓜病害发生情况日益严重[2]。尖孢镰刀菌（Fusarium  oxysporum）侵染引起的枯萎病和亚隔孢壳属（Stagonosporopsis）危害引起的蔓枯病是西甜瓜生产上两种主要病害[3-7]。目前设施栽培常年连作伴随病菌量加大、高温高湿等农业生态条件恶化，导致病害高发、重发，生产上植株死亡率可达 30%～40%，严重可达80%以上[4，8-9]，已成为制约西甜瓜产业发展的重要因素。

生产上发生西甜瓜枯萎病、蔓枯病后，仍以化学药剂防治为主，长期使用化学农药易产生抗药性、农药残留和环境污染，使得西甜瓜枯萎病、蔓枯病等防治越发成为生产上的难点[4，10]。培育及推广优质复合抗病西甜瓜新品种是控制枯萎病、蔓枯病最为环保、经济、有效的办法[5，11，12]。然而开展复合抗性育种研究，品种资源对枯萎病和蔓枯病的复合抗病性鉴定是首要工作。抗病性鉴定是抗病育种的基础，而符合生产实际的抗病性鉴定技术方法又是抗病性鉴定的关键，制定出准确、快捷的复合鉴定技术，可提高抗病育种的准确性，加速抗病育种进程[13]。抗性品种与抗性鉴定方法结合，促进西甜瓜抗性品种的推广与应用。

目前国内生产上尚无发布实施的关于西瓜甜瓜枯萎病、蔓枯病单独或者两种病害联合抗性鉴定技术标准可参考，只有一些国内外抗性鉴定方法的文献报道，但是目前国内外对西甜瓜枯萎病、蔓枯病的抗性鉴定方法多采用分株单一接种法，比如枯萎病苗期浸根接种、灌根接种、叶子刺伤接种[12，14-17]，以及通过苗期蔓枯病孢子悬浮液的喷雾接种、离体接种等[13，18]。分株单一接种法效率低、耗费种子等试验材料多，且不同批次试验不稳定。也有少量报道枯萎病、蔓枯病复合接种，即都以活体先后接种枯萎病和蔓枯病菌[12，19]，然而目前的复合接种方法同时活体接种两种病原菌，往往会造成病害发病交互影响，病情指数偏高，容易产生误导性结果，而且由于枯萎病菌对感病植株是致命的，接种后基本全部死亡，无法同时进行其它多抗性苗期鉴定试验，对感枯萎病材料如需鉴定蔓枯病等其它抗病性，后期仍需要进行不同批次的单独接种试验，导致传统枯萎病和蔓枯病的双重抗性鉴定不在同株同时鉴定的，影响结果一致性，拉长鉴定周期。因此為更加简便、高效鉴定西瓜甜瓜品种（系）对枯萎病、蔓枯病抗性，针对当前单一接种为主的技术不足，亟需制定适合大量快速抗源筛选，能够避免不同病害发病交互影响病情观察和统计结果，且鉴定结果更快速准确的抗病性联合鉴定技术规程。

本文建立了西甜瓜品种（系）枯萎病苗期活体和蔓枯病离体叶片联合抗性接种鉴定技术方法，实现了同一植株同时鉴定枯萎病和蔓枯病两种病害的抗性，缩短鉴定周期，避免病害交叉影响、提高鉴定稳定性、节约试验材料等，适合大量快速抗源筛选。以期为广大西甜瓜科研育种及品种试验推广等单位和个人，提供可参考的快速联合抗性鉴定技术规范。以推动西甜瓜抗枯萎病、蔓枯病育种，保障西瓜甜瓜种业提升。

1 试验材料

1.1 鉴定品种（系）、对照品种选择及育苗管理

1.1.1 鉴定品种（系）和对照品种：联合抗性鉴定中除了所参鉴的西瓜、甜瓜品种（系），还可选一个感病对照和一个抗病对照。西瓜枯萎病抗病对照可采用高抗品种‘卡红，感病对照可选用感病品种‘苏蜜1号；甜瓜枯萎病抗病对照可选用‘长香玉，感病对照可选‘苏甜二号。西瓜蔓枯病抗病对照可采用材料‘PI189225，感病对照可选用感病品种‘苏蜜1号；甜瓜蔓枯病抗病对照可选用抗病材料‘PI200819，感病对照可选‘苏甜4号。

1.1.2 育苗管理：鉴定品种（系）和对照品种在播种前将供试种子用10%次氯酸钠溶液浸泡5min，流动清水冲洗去除表面残留消毒液，种子放在铺有吸水纸培养皿中，置30℃～32℃恒温培养箱内催芽。待种子露白后，播于50孔穴盘（泥炭∶蛭石∶珍珠岩=3∶1∶1混合基质填装）内，每份材料种植25株，3次重复。育苗温度保持在白天26±2℃，夜间16±2℃，待出苗长至3～5片真叶时的植株作为备用。 活体接种枯萎病菌后的西瓜甜瓜植株，定植于装有灭菌育苗基质的直径为10cm的营养钵中，置于26±2℃的温室培养管理，待后续病情观察。

1.2 病原菌来源及扩繁

1.2.1 病原菌来源：尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum（Schl.）f.sp.niveum（E.F.Smith）Snyder  &  Hansen）为害的西瓜枯萎病以生理小种1为优势小种，为此宜选用1号生理小种Race1。甜瓜枯萎病菌株用尖孢镰刀菌甜瓜专化型（Fusarium oxysporum（Schl.）f.sp.melonis（Leachet  currence）Snyder  et  Hansen）。蔓枯病菌株（Stagonosporopsis  citrulli.DBJSSY2[7]）采用从病田收集、分离，并经致病性鉴定后所得的致病性强且稳定的株系。

所有选用的病原菌系江苏省农业科学院蔬菜研究所分离、鉴定和保存的菌株。

1.2.2 病原菌孢子繁殖：枯萎病菌孢子悬浮液准备：参考耿丽华等[15]的方法，取西瓜枯萎病菌接种于马铃薯固体培养基（葡萄糖 20g，马铃薯200g，琼脂15g，水1000mL），26±2℃培养5天，再将培养好的枯萎病菌丝块接种于马铃薯培养液（葡萄糖20g，马铃薯200g，水1000mL），26±2℃，150r/min培养5～7天，4层纱布过滤后，加无菌蒸馏水稀释，用血小球计数板计数，配制成浓度为5×105孢子/mL的孢子悬浮液备用。蔓枯病菌孢子悬浮液准备：参考Li等[7]方法诱导蔓枯病菌产生分生孢子。取蔓枯病病菌接种于马铃薯固体培养基（葡萄糖20g，马铃薯200g，琼脂15g，水1000mL），26±2℃培养5～7天。选取新鲜无伤口的黄瓜经流动水冲洗干净后，75%酒精擦拭表面，晾干后，在黄瓜表面轻微削去小块表皮，培养好的菌株用直径0.7cm的滅菌打孔器打取菌丝块，菌丝块倒置于黄瓜伤口上，培养箱中26±2℃培养，5～7天后分生孢子产生，用刀片刮取，研磨，4层纱布过滤后，加无菌蒸馏水稀释，用血小球计数板计数，配制成5×105孢子/mL的孢子悬浮液备用。

1.3 离体叶片准备

取直径9cm的培养皿，底部铺设用苯并咪唑植物保鲜水溶液（11.8mg/L）浸湿的滤纸，然后从之前准备的未接种枯萎病的健康植株上每株取1～2片真叶，放置于滤纸上，以备蔓枯病菌接种用。

2 枯萎病苗期活体蔓枯病离体叶片联合接种方法

枯萎病苗期活体接种：将前期在穴盘中长至3～5片真叶的待用植株小心取出，根部用清水轻柔洗净，吸水纸吸去多余滴水，然后在提前备好的枯萎病菌孢子悬浮液中浸5min，取出移栽于装有灭菌基质，直径为10cm的营养钵中，置于26±2℃温室培养，接种3天后开始统计病情。

蔓枯病离体叶片接种：将蔓枯菌孢子悬浮液（添加1% Tween  80）均匀喷到准备好的同批次同植株离体叶片上，每个叶片约喷雾500μL，然后把培养皿置于光照培养箱中，培养条件为：温度26±2℃，光照周期16h光照/8h黑暗，相对湿度约90%，1天后观察病情并统计数据。

3 病害调查与结果评价

3.1 枯萎病调查分级评价

接种枯萎病菌孢子液后3d开始记录生长及病情，植株按接种后症状与病情分为6个级别标准[20]：0级：无病症；1级：午间子叶萎蔫或部分子叶与真叶轻微萎蔫，夜间尚能恢复；2级：1个真叶萎蔫或子叶较重萎蔫；3级：子叶及60%以上真叶萎蔫，影响生长；4级：整株出现萎蔫，60%以上叶枯死，但是心叶仍存活；5级：整株严重萎蔫并枯死；其中，2级以下为抗病植株，3级以上为感病植株；根据公式（Ri（发病率）=100%×ni（发病植株数）/nt（总调查植株数）计算进行抗性评价。

结果分四个抗性等级（详见表1），在感病对照发病率达80%以上，判定为鉴定有效，对植株发病数进行计数分析。

3.2  蔓枯病调查分级评价

参考张永兵等[18]优化蔓枯病的调查分级，依据离体叶片上病斑的大小进行分级，各病情分级标准如下：0级：叶片没有病斑；1级：叶片病斑面积≤25%；2级：25%<叶片病斑面积≤50%；3级：50%<叶片病斑面积≤75%；4级：75%<叶片病斑面积≤100%。蔓枯病接种3d后离体叶片开始出现病斑症状，在感病对照病情指数达60.0以上时，判定为鉴定有效。调查结果按公式（2）计算病情指数（DI）。根据计算结果分为6个抗性等级（详见表2）。

DI—病情指数；dc—相应病级；nc—各病级病叶数；nt—总叶片数。amax—最高病情分级值。

3.3  西瓜品种枯萎病和蔓枯病苗期联合抗性鉴定结果评价

由表3结果，根据枯萎病抗性评定标准，苏蜜1号发病率为81.25%，鉴定为枯萎病感病品种，卡红发病率为18.75%，鉴定为枯萎病高抗品种；利用西瓜苗离体叶片鉴定西瓜品种蔓枯抗性，苏蜜1号病情指数为81.48，根据蔓枯病抗性评定标准为蔓枯病高感病品种，W7病情指数为39.81，为蔓枯病中抗品种。

鉴定结果表明，苏蜜1号为枯萎病感病、蔓枯病高感病品种；卡红为枯萎病高抗品种、蔓枯病感病品种，W7为蔓枯病中抗品种，与预期对照相应抗病性符合。

4 注意事项

（1）枯萎病接种试验主要需注意控制温度条件，粗放的环境条件下，建议避开夏季高温和冬季低温，环境温度宜控制在25℃～30℃，气温过高或过低都不利于枯萎病发病。（2）注意用于蔓枯病病菌产生分生孢子的黄瓜材料需要选择新鲜的黄瓜果实。（3）用马铃薯液体培养液制备培养枯萎病菌孢子过程中，建议在培养液中加入链霉素等抗生素，防止细菌污染。（4）注意接种后每天都要定期观察发病情况。

5 讨论与结论

本鉴定技术方案对西甜瓜枯萎病、蔓枯病的病原菌种类、来源、扩繁、孢子液制备，同批同株苗期活体与离体叶片联合抗病接种鉴定方法及评价指标进行系统性描述总结。该联合鉴定技术方案将为抗枯萎病、抗蔓枯病的复合抗性种质资源的筛选和品种选育提供技术辅助，该技术方案克服了之前的分株不同时的单一接种鉴定蔓枯病和枯萎病的抗病性，或者活体先后接种等方法的各自缺点[12，19]。比如以往活体先后接种后，枯萎病菌对感病植株是致命的，两种病害接种相互影响病情，对感枯萎病材料如需继续鉴定蔓枯病等其它抗病性，需要再次进行不同批次的单一接种试验等缺点[13-14]，而本方案明确了蔓枯病采用离体叶片孢子悬浮液喷雾的接种方式，同时还优化了蔓枯病的病情评价分级，而且实现在同批次同植株上同时鉴定两种病害的抗性，提高效率，大大缩短了接种后所需等待时间。

本方案提供一种在同一植株同时鉴定西甜瓜枯萎病和蔓枯病抗性的可靠方法，避免了不同病害交叉侵染影响病情结果和不同批次试验不稳定问题。适合大量快速抗源筛选，缩短了周期，提高了鉴定效率，避免了错选率，也节约了鉴定材料，更有利于在实际工作中推广应用。

参考文献

[1] 王娟娟，李莉，尚怀国.我国西瓜甜瓜产业现状与对策建议[J].中国瓜菜，2020，33（05）：69-73.

[2] 李天来，许勇，张金霞.我国设施蔬菜、西甜瓜和食用菌产业发展的现状及趋势[J].中国蔬菜，2019，1（11）：6-9.

[3] 胡凤云，莫贱友，韦继光，等.西瓜甜瓜蔓枯病防治研究进展[J].中国瓜菜，2011，24 （06）：40-44.

[4] 顾美玲.西甜瓜枯萎病化学防治和生物防治初步研究[D].吉林：吉林农业大学，2019.

[5] 徐彦刚，姚协丰，李良俊，等.西瓜品种（品系）对蔓枯病的抗性鉴定与评价[J].江苏农业学报，2021，37（01）：106-115．

[6] StewartJ E，Turner A N，Brewer M T.Evolutionary history and variation in host range of three Stagonosporopsis species causing gummy stem blight of cucurbits[J].Fungal Biology，2015，119（05）：370-382.

[7] Li P，Ren R，Yao X F，et al.Identification and Characterization of the Causal Agent of Gummy Stem Blight from Muskmelon and Watermelon in East China[J].Journal of Phytopathology.2015，163（04）：314-319.

[8] 李英.瓜类蔓枯病菌的生物学特性和黄瓜抗病资源的筛选[D]．南京：南京农业大学，2007.

[9] 西瓜枯萎病土壤含菌量的测定与防病关系研究[J]中国西瓜甜瓜，1993，1（02）：12-14．

[10] Keinath  A  P，Holmes  G  J，Everts  K  L，et  al.Evaluation  of combinations  of  chlorothalonil  with  azoxystrobin，harpin，and  disease forecasting  for  control  of  downy  mildew  and  gummy  stem  blight  on  melon [J].Crop  Protection，2007，26（02）：83-88.

[11] Wehner  T  C，Shetty  N  V.Screening  the  cucumber  germplasm collection  for  resistance  to  gummy  stem  blight  in  North  Carolina  field tests[J].HortScience，2000，32（6）：1132-1140.

[12] 宋榮浩，戴富明，杨红娟，等.西瓜品种资源对枯萎病和蔓枯病的抗性鉴定[J].植物保护，2009，35（01）：117-120.

[13] 姚协丰，徐锦华，李苹芳，等.菜瓜蔓枯病苗期抗性鉴定方法比较[J].中国瓜菜，2017，30（02）：11-14.

[14] 张学炜，钱笑丽，古勤生.西瓜抗枯萎病鉴定方法研究[J].果树科学，1991，8（04）：219-224.

[15] 耿丽华，郭绍贵，吕桂云，等.西瓜枯萎病菌生理小种鉴定技术体系的建立和验证[J].中国蔬菜，2010，1（20）：52-56.

[16] Martyn  R  D，Mclaughlin  R  J.Effects  of  Inoculum  Concentration  on the  Apparent  Resistance  of  Watermelons  to  Fusarium  oxysporum  f.sp. niveum[J].Plant  Disease，1983，67（05）：493-495.

[17] 王登明，张学军，冯炯鑫，等.甜瓜枯萎病接种方法比较试验初报[J].中国瓜菜，2009，22（05）：38-39．

[18] 张永兵，王登明，张聪，等.甜瓜蔓枯病离体接种方法初步研究[J].新疆农业科学，2009，46（03）：521-525.

[19] 张学军，李寐华，等.甜瓜苗期复合接种多抗性方法研究[J].北方园艺，2013，1（01）：138-140.

[20] Meru  G，Mcgregor  C.Genotyping  by  sequencing  for  SNP  discovery and  genetic  mapping  of  resistance  to  race  1  of  Fusarium  oxysporum  in watermelon[J].Scientia  Horticulturae，2016，209（09）：31-40.

[21] Smarty  R  D，Bruton  B  D.An  initial  survey  of  the  United  States  for races  of  Fusarium  oxysporum  f.sp.niveum[J].HortScience，1989，24（04）： 696-698.