浓香型白酒酿造过程中酒醅微生物区系变化特征分析

陈 进，陈 萍，谭光迅，杨 博，龚大春，4

（1.湖北省生物酵素工程技术研究中心(三峡大学)，湖北宜昌 430072；2.湖北稻花香酒业股份有限公司，湖北宜昌 443112；3.三峡大学生物与制药学院，湖北宜昌 443002；4.中国轻工业功能酵母重点实验室(三峡大学)，湖北宜昌 430072）

中国白酒作为世界六大蒸馏酒之一，广受世界人民的喜爱。根据主体香型的不同，中国白酒大体上可分为三大类：浓香型、酱香型和清香型。浓香型白酒以其“窖香浓郁、绵甜爽净、香味协调、余味悠长”的特点深受消费者喜爱[1]。浓香型白酒的生产以泥窖窖池为基础，发酵过程是栖息在窖池糟醅、窖泥中的庞大微生物区系在糟醅固、液、气三相界面的复杂的物质能量代谢过程[2]，以富含淀粉的粮谷类为原料，以酒曲为糖化剂，采用续糟拌和、混蒸混烧、凉醅下曲、分层分批入窖、固态发酵、蒸馏出酒、精心勾兑等工艺进行生产[3]。浓香型白酒的酿造过程是传统的封闭式固态发酵，复杂的微生物群落除了受到环境微生物、原料、环境温度、环境湿度等外源因素的影响，还受到群落自身演替、代谢产物变化、生物热变化、含水量变化等内源发酵条件的影响。目前国内主要对浓香型白酒的酒曲、窖泥以及短期发酵过程的微生物菌群进行了跟踪研究，对于长期的窖池发酵以及空间上菌群的结构差异研究不足。

对发酵过程中窖池内微生物区系变化特征的研究就是对在窖池环境下微生物生态学的研究。微生物生态学的研究内容包括确定微生物的数量、群体结构和活性，对于保护和改善生态环境、构建人工生态系统、提高废水生物处理的效率有着重要的科学意义和实用价值[4]。传统的微生物鉴定方法操作简单，可以直接获取目标微生物，一直沿用至今。自然界中超过99%的微生物都是不可直接培养的，绝大多数微生物不能通过纯培养的方式获得。传统分离培养的方法工作量大，不能完整反映微生物复杂的群落组成[5]。施安辉[6]采用稀释平板涂布的方法，发现了酒醅中的细菌、酵母菌和霉菌的数量变化特征；吴衍庸等[7]考查了窖池中不同位置窖泥中六大类厌氧菌（甲烷菌、梭状芽孢杆菌属、乳酸菌、硫酸盐还原菌、硝酸盐还原菌及厌氧异氧菌）的差异性；岳元媛等[8]采用厌氧培养方法对窖泥中的细菌进行筛选分离，共筛选到8 个属的细菌，绝大多数为兼性厌氧细菌，梭菌属细菌仅占1%左右，这与采用未培养技术得到的结果大相径庭，采用传统培养技术对环境微生态的研究不足以全面准确的发现微生物的菌群结构和演替特征。随着科学的进步，分子生物学手段逐渐进入了生态学研究的视野并成为生态学研究的重要技术，“高通量测序技术（High-Throughput Sequencing）”以其测序量大、灵敏、高速、高信息量、低成本等特点成为微生态学研究中应用的热门技术[9]。高通量测序技术是对第一代测序技术的一次技术革新，可以同时对千万条DNA 序列进行测序，所以高通量测序技术也被称为“第二代测序技术”“下一代测序技术（Next Generation Sequencing，NGS）”和“深度测序”[10]。高通量测序为研究人员和科学家提供了一种革命性的工具，可以快速、经济地获取DNA 序列。与传统的Sanger 测序相比，使用高通量测序获得的每单位DNA 序列（即碱基对）显著更具成本和时间效益。雷振河[11]应用高通量测序技术对清香型白酒酿造用大曲和酒醅中微生物构成进行了分析，发现大曲中优势真核微生物主要包括曲霉菌属、热子囊菌属、根霉菌属、嗜热真菌属、假丝酵母，醋酸杆菌科和乳杆菌科是清香型发酵酒醅中优势原核微生物，占原核微生物70%以上；邓杰等[12]利用高通量测序技术研究浓香型白酒窖池窖泥微生物群落结构，发现Clostridiales Family XⅠ.Incertae Sedis 随着窖龄的增加呈现减少的趋势，Actinobacteria 类群和Synergistetes 类群随着窖龄的增加呈现增加的趋势，Haloplasmataceae 类群和Clostridiaceae类群只在30 年窖龄的窖池中有检测出，Lactobacillaceae类群和Porphyromonadaceae类群只在30年窖龄的一口窖池中是优势细菌类群；李欣等[13]通过高通量测序技术对酱香型白酒福矛窖酒发酵的不同时期酒醅微生物进行多样性分析，发现堆积发酵酒醅的优势微生物为乳球菌属、醋酸杆菌属、芽孢杆菌属、梭形杆菌属、假丝酵母属、曲霉属，窖内发酵酒醅的优势微生物为乳杆菌属、醋酸杆菌属、青霉菌属、毕赤酵母属、曲霉属、嗜热子囊菌属、假丝酵母属；李斌等[14]基于Illumina Miseq 测序方法研究了浓香型白酒中高温酒曲和芝麻香型白酒高温酒曲的微生物菌群结构，结果表明浓香型白酒中高温酒曲的优势类群主要有9个属，包括乳杆菌属（Lactobacillus）、魏斯氏菌属（Weissella）和片球菌属（Pediococcus）等，芝麻香型白酒高温酒曲的优势类群主要有芽孢杆菌属（Bacillus）和别样芽孢杆菌属（Allobacillus）；栗连会等[15]利用16S rRNA基因高通量测序技术比较了大曲、酒醅和窖泥中的乳酸菌群落结构，并解析了酒醅乳酸菌在发酵过程中的动态变化，结果表明，发酵过程酒醅中存在49 种乳酸菌，其中16 种来源于大曲，3 种来源于窖泥，酒醅乳酸菌群落结构在发酵的第一周出现剧烈变动，发酵2 d 后Lactobacillus acetotolerans取代Weissella confusa成为优势微生物并保持至发酵结束。

本研究拟利用高通量测序技术，探究发酵过程中微生物结构以及主要的功能微生物，结合环境因子，分析其对浓香型白酒发酵过程微生态结构的影响。了解浓香型白酒酿造过程中微生物资源状况，进一步认识其生态功能，加强对窖池微生物资源的利用。有利于改善白酒的生产工艺，为进一步提高浓香型白酒的品质、人工改造窖池微生物菌群等提供生物学依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂

样品：取样于湖北某酒厂生产一车间中的某一窖池，选取发酵1 d、3 d、9 d、15 d、30 d、70 d、90 d为发酵节点，采用四点取样法对窖池四个角共取30 g左右样品混合，分别取窖池每个节点的上层（距离窖顶40 cm）、中层（距离窖顶1 m）、底层（距离窖底40 cm）三层糟醅的样品，共计21 个样本（样本编号见表1）。混合均匀后分成两份样品，一份-20 ℃保存并及时进行酒醅微生物基因组DNA 提取，另一份进行理化性质和有机酸含量检测。

表1 糟醅样品编号

试剂及耗材：葡萄糖、3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、重蒸苯酚、亚硫酸钠、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙醇、乙酸、丁酸、己酸、乳酸（均为分析纯），天津科密欧化学试剂有限公司；Fast DNATMSPIN Kit for Soil，美国MP Βiomedicals公司。

1.2 试验方法

1.2.1 酒醅相对酸度的测定

取5 g 酒醅，加入45 mL 蒸馏水，置于漩涡振荡器上混合均匀。静置5 min，测定上清液pH值。

1.2.2 酒醅还原糖的测定

采用3,5-二硝基水杨酸(简称DNS)—分光光度计法于540 nm 波长处测定。样品预处理：取酒醅样品1.0 g 于25 mL 比色管中，加入10 mL 蒸馏水100 ℃水浴20 min，冷却后，取上清液1 mL 于1.5 mL EP管中8000 r/min离心10 min取上清液。

1.2.3 高通量测序与数据分析

高通量测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。高通量测序针对细菌16S rRNA 基因V3～V4 区域，扩增引物为338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') 。测序平台为Illumina MiSeq。去掉Βarcode 序列和引物序列，得到有效的序列文件，在此基础上对测序数据的质量进行控制，去掉测序质量不好的序列，保留测序长度大于400 bp 的序列，并去除嵌合体序列，得到合格的有效数据。使用Usearch 将序列按照97 %相似度聚类，进 行OTU(operational taxonomic units，操作分类单元) 划分，提取代表序列，得到OTU 表。将细菌利用Mothur 方法与SILVA 的SSU rRNA 数据库进行物种注释分析。使用Mothur 软件计算样品的Chao1、Ace、Shannon、Simpson 和Goods-coverage指数。

1.2.4 数据分析

酒醅理化指标的试验结果用平均值±标准差表示；利用R 语言（3.6.3 版本）进行物种多样性聚类分析和相关性分析。

2 结果与分析

2.1 发酵过程中酒醅pH值、还原糖的变化规律

浓香型白酒发酵过程中pH 值、还原糖的变化如图1 所示。三层糟醅的pH 值呈先上升后下降的趋势，0～9 d，酒醅pH 值由4.80 下降至3.30 左右，中层下降幅度大；9～90 d，pH 值总体呈上升趋势，上升幅度较小。三层糟醅还原糖含量总体呈下降趋势，由发酵初始的100 mg/g 干糟醅下降到10 mg/g干糟醅。

图1 糟醅理化指标(pH值及还原糖)发酵变化

2.2 酒醅细菌群落α-多样性分析

本研究利用高通量测序技术对浓香型白酒发酵过程酒醅中细菌群落结构进行分析。21 个样品测序深度为54428～84789 条，经过对测序获得数据的拼接和过滤处理，21 个样品平均每个样品有54049 条有效序列，613 个OTU。每个样品中有效序列数为148～91317，OTU 数量在26～1058 之间，每个样品有效序列的覆盖率为98.8 %～99.8 %，表明基于有效序列的α-及β-多样性分析能较好地反映酒醅微生物群落信息。

通过α-多样性分析可知，Chao1 指数在89.33～1618.53 之间，Ace 指数在155.69～2237.38，Shannon 指数在0.26～3.28 之间，Simpson 指数在0.09～0.93 之间。从原核微生物群落演替性来看（图2），随着发酵的进行，Chao1 和Ace 指数表征菌群的丰富度（richness），Chao1 和Ace 指数越大，菌群的丰富度越高。两个指数总体上呈先上升后下降的趋势，表明糟醅中的原核微生物丰富度先升高后降低，可能是窖泥和环境中的原核微生物菌群在糟醅中大量生长繁殖，后期因窖池环境恶化导致原核微生物菌群多样性降低。底层糟醅在90 d 时原核微生物丰富度有明显的下降，底层有机酸大量聚集，较上层和中层酸度和渗透压更低。Shannon 及Simpson 指数表征物种的均匀度，Shannon 指数越高、Simpson指数越小，菌群的均匀度越高。这两个指数的变化趋势在时间上波动性较大，在空间上也有明显的区别，表明菌群的均匀度变化较大。将这几个指标与发酵时间做差异性分析，Chao1、Ace 和Shannon 指数与发酵时间的差异性指数为0.017、0.016、0.046、0.162，均小于0.05，表明不同发酵时间，菌群多样性有显著性差异。不同层糟醅指数的差异性均大于0.05，表明在空间上，不同层糟醅的多样性不存在显著差异。

图2 糟醅发酵过程中CHAO1、ACE、SHANNON及SIMPSON多样性指数分析

2.3 糟醅细菌群落组成

根据高通量测序分析结果，选取在属分类水平上相对丰度排名前十的菌属，生成物种相对丰度分布柱状图，见图3。10 个优势菌分别为乳酸杆菌属（Lactobacillus）、醋酸杆菌属（Acetobacter）、假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、Sphingopyxis、Rummeliibacillus、魏斯氏菌属（Weissella）、片球菌属（Pediococcus）、根瘤菌（Rhizobium）。发酵初始菌群与其他发酵节点菌群有较大差异，主要有乳酸杆菌属（Lactobacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、葡萄球菌属（Staphylococcus），在三层糟醅中平均占比分别为19.11 %、17.16 %、12.84 %、9.95 %。发酵第3 天，醋酸杆菌属（Acetobacter）占比较大，大约为52.74%，在1～3 d 大量增殖后丰度逐渐降低，发酵30 d 时丰度小于1%。醋酸杆菌是好氧菌，1～3 d 内窖池内存在一定量的溶解氧含量，丰度迅速升高，随后溶解氧含量降低，其丰度逐渐下降。乳酸杆菌属（Lactobacillus）在发酵1～30 d 丰度急剧升高，由19.11 %上升到96.42 %，70～90 d 乳酸杆菌属（Lactobacillus）相对丰度有所下降，仍占较高优势。乳酸杆菌是兼性厌氧菌，在氧气含量较低时也能生长繁殖。醋酸杆菌的主要发酵产物是醋酸，是丁酸、己酸生成的前体物质，乳酸菌的主要发酵产物有乳酸、乙醇、乙酸等，是乳酸乙酯和乙酸乙酯生成的前体物质，乳酸菌的产酸特性能维持窖池内的低pH 值环境，抑制杂菌的生长。因此，醋酸杆菌和乳酸杆菌对白酒酿造过程有重要影响，是各种风味产物形成的基础。

图3 在属水平浓香型白酒糟醅细菌群落组成

2.4 酒醅细菌群落聚类分析

每个样品中含量≥0.5%的属定义为优势属并将其用于β 多样性分析，以R 语言vegan 包计算Βray-Curtis 指数，绘制聚类树图。从图4 可看出，21 个样品可以聚类为3 簇，第一簇包含了1 d 和3 d的样品，第二簇包含了9 d和15 d的样品，第三簇包含了30 d、70 d 和90 d 的样品。表明糟醅样品可按发酵时间分为三个阶段，即发酵前期（1～3 d）、发酵中期（3～15 d）、发酵后期（15～70 d）。PCA分析图与聚类树图的结果一致。另外，在窖池不同层面上，同一发酵时间三层酒醅能够聚类在一起，表明空间上菌群的差异较小且弱于时间的差异，中层与底层的菌群相似度更高，与上层糟醅菌群存在一定差异。Adonis 多因素方差分析结果显示，上述分组对样品差异的解释度为0.60184，P 值为0.001，组间差异性显著。充分说明浓香型白酒发酵每个阶段的细菌菌群组成发生了明显的变化，且将发酵过程分为3个发酵阶段是合理的。

图4 不同发酵时间及深度糟醅样品Β多样性分析聚类树图及PCA图

2.5 细菌群落演替与环境因素变化的相关性

采用RDA 分析浓香型白酒发酵过程中细菌群落结构与11 个理化因子之间的关系，结果发现（图5），前2 个排序轴分别解释群落结构与理化因子变化率的82.45%和15.22%。还原糖与pH 值之间夹角为锐角，二者呈正相关性，且均与其他理化指标呈负相关性。还原糖、乙醇、含水量、乳酸、乳酸乙酯、乙酸乙酯和丁酸乙酯是对菌群结构影响较大的理化因子。RDA 结果还揭示了主要的细菌类群与理化因子的关系，具体而言，Bacillus、Pseudomonas、Staphylococcus、Weissella与pH值呈正相关，Lactobacillus与乙醇、含水量、丁酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯和乳酸呈正相关。

图5 糟醅细菌菌群与环境因子的RDA分析

3 结论

本研究以浓香型白酒发酵过程中糟醅为研究对象，通过高通量测序技术探究了浓香型白酒发酵过程中的细菌多样性。假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、醋酸杆菌属（Acetobacter）为发酵前期的主要菌属，在发酵前期（1～9 d），群落物种丰富，随着发酵继续进行，细菌群落组成发生显著改变，最终乳酸杆菌属成为相对优势菌属。对浓香型白酒发酵过程中的理化特性变化情况进行了分析，总体而言，随着发酵的进行，pH 值和还原糖含量降低。由RDA 分析可知，糟醅中微生物的种群结构与糟醅的理化指标存在明显关联，且还原糖含量与微生物物种分布相关程度最大，乳酸杆菌属对糟醅理化指标的影响较大。本研究探究了浓香型白酒糟醅在不同发酵阶段中细菌群落及理化特性的变化规律及相互关系，有助于构建关于浓香型白酒糟醅微生物多样性的系统认识体系，后续可通过分析发酵过程中微生物具体代谢途径和机理探究其对糟醅及浓香型白酒的风味和品质的作用，以期为浓香型白酒工业化发展提供理论基础。