补肾活血固齿方对MC3T3-E1细胞超微结构及I型胶原蛋白影响的实验研究

杨梦华 杨运田 都广艳 赵 玲 高 毅 王双双 李 蓓

牙周炎是牙龈炎症波及深层的牙槽骨、牙周膜、牙骨质，造成牙槽骨萎缩、牙齿逐渐松动，甚至脱落，现已成为口腔科常见病、多发病和突出的口腔健康难题[1]。临床上常规应用的龈上洁治，龈下刮治等操作仅能阻止牙周炎症的进展，不能有效恢复牙周组织；而再生性治疗，如引导性骨组织再生术，虽然能获得一定程度上的软硬组织的修复，但是效果有限[2]。Jørgen Slots 提出同时调节宿主和危险因素的方法治疗牙周炎，效果明显提高[3]。中医药注重整体观念，辨证施治，通过调节宿主，提高对外界危险因素的抗性治疗疾病[4]。

牙槽骨作为人体骨骼中代谢最活跃的组织，其代谢的稳定依赖于成骨细胞和破骨细胞的动态平衡。治疗牙周炎的关键是抑制牙槽骨吸收或促使牙槽骨的再生，使成骨大于破骨。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，是牙周支持组织中的重要细胞，在骨基质的合成、分泌和矿化中起着核心作用。通过全身免疫调节增加成骨细胞的数量、增强成骨细胞的骨化能力，在牙周炎治疗过程中尤为重要。我科应用补肾活血固齿方治疗肾虚血瘀型牙周炎，疗效满意[5]，该方剂是以“肾主骨”理论为基础的中药方剂，为了探究其作用机制，观察其是否通过促进成骨细胞增殖、分化，增强成骨细胞的骨化能力，促进牙槽骨的再生而发挥作用。

笔者进行了系列研究，前期研究发现补肾活血固齿方对小鼠颅顶前成骨细胞（MC3T3-E1）增殖活性及细胞周期无影响[6]，进一步研究发现该方剂可能通过增强MC3T3-E1 细胞中碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性、提高MC3T3-E1细胞骨钙素（osteocalcin,OCN）分泌水平,促进MC3T3-E1细胞矿化结节形成促进该细胞向成骨细胞分化成熟[7～9]。该方剂可能通过促进MC3T3-E1 细胞分泌血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor, PDGF）和骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein-2，BMP2）参与诱导成骨，通过钙离子通道TRPV6 上调骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2,BMP2）诱导成骨细胞的分化[10～12]。

小鼠颅顶前成骨细胞（MC3T3-E1 细胞）是1981年由日本学者从新生的C57BL/6 小鼠颅骨中分离并体外培养出来的，该细胞在体外可连续培养并确保遗传物质的稳定，是研究体外成骨细胞超微结构的最佳模型[13]。Ⅰ型胶原蛋白（Collagen TypeⅠ, ColⅠ）是成骨细胞合成的成纤维胶原，骨基质蛋白，通过矿化促进骨量的增加，是成骨细胞向基质成熟方向分化的标志，ColⅠ基因缺陷会引起骨发育障碍性疾病，影响骨矿化，不能形成骨结节，造成成骨不全[14]。本实验通过观察补肾活血固齿方对MC3T3-E1 细胞ColⅠmRNA 和MC3T3-E1 细胞超微结构的影响，进一步研究该方剂成骨的作用机制，为临床应用提供理论依据。

资料和方法

1. 试剂与仪器:α-MEM 培养基（美国GIBCO 公司），胰酶（Amresco），Triton x-100（Solarbio），反转录试剂盒（invitrogen）PCR SuperMix 扩增试剂盒（invitrogen），荧光定量PCR 试剂盒（TaKaRa）。HF240 二氧化碳培养箱（上海力申科学仪器有限公司），BSC-1100ⅡA2生物安全柜（北京东联哈尔仪器制造有限公司），25 cm2（50 mL）细胞培养瓶（加拿大Jetbiofil 公司）,TE2000-U 荧光倒置显微镜（日本NiKon 公司），D-37520 高速离心机（Thermo ELECTRON CORPORATION），B40 低速离心机（安新县白洋器材公司），HKA-A2450-230 精密电子天平（意大利BEL Engineering公司），H-7500透射电镜（HITACHI 日立公司），DK-600A 电热恒温水箱（上海一恒科技有限公司），SHAL水浴恒温振荡器（江苏金坛市江南仪器厂），DDY-7C 型电泳仪（北京市六一仪器厂），7500 全自动荧光定量PCR 仪（ABI,USA），小鼠颅顶前成骨细胞亚克隆14（MC3T3-E1 Subclonel4），购自中国科学院上海细胞库（ATCC CRL-2594）。

2. 实验动物：16 只清洁级的健康雄性SD 大鼠，体重280～300 g，合格证编号1312020，购于河北医科大学的实验动物中心。饲养条件室温保持在18℃～25℃，空气流通，12 h 维持光照，动物在笼中自由饮水摄食。

3. MC3T3-E1 细胞的培养:倒置相差显微镜下观察MC3T3-E1 细胞，细胞铺满瓶底。37℃超净台内，倒掉原培养基，PBS 清洗2 遍，加入0.25%胰酶1 mL 后立即镜下观察，当细胞胞体变圆、收缩，立即放回超净台内加入2 mL α-MEM 培养基终止消化。用吸管反复吹打细胞，使所有细胞脱离瓶壁，然后移至15 mL 的离心管中，1000 r/min 离心5 min 后倒掉上清液，加入6 mL αMEM+10%FBS 培养基，吸管轻轻吹打混匀。平均分装至3 个培养瓶，37℃、5%CO2的培养箱中培养，培养5～6 d后细胞逐渐贴壁，随着培养时间的延长，细胞数量逐渐增多，细胞表面伸出较多突起，胞核清晰可见，细胞形态更加丰满。每3 d 更换一次细胞培养液，培养约5～7 d 时细胞铺满瓶底约80%时，细胞处于对数生长期，细胞状态良好，细胞用于后续实验。

4. 补肾活血固齿方药液制备:补肾活血固齿方由淫羊藿15 g、补骨脂15 g、熟地黄10 g、当归10 g、丹参10 g、知母10 g、甘草3 g 组成。药物中加入10倍量蒸馏水煎煮1.5 h 后过滤，加同等量蒸馏水再次煎煮1.5 h过滤，2次滤液混合煎煮浓缩至150 mL，装袋备用。

5. 分组及血清制备：实验设含药血清组（含有10%含药血清）、无药血清组（含有10%无药血清）、胎牛血清组（含有10%胎牛血清）。16 只SD 大鼠随机分到含药血清组和无药血清组，每组8 只。①含药血清制备：按人与动物之间体表面积折算的等效剂量比值给药。补肾活血固齿方人的给药量剂量为73 g/d，换算成大鼠给药量为7.6 g/(kg.d)，大鼠每日灌胃2 次，灌胃前6 h 禁食，不禁水，连续灌胃7 d。第7 d两次灌胃后2 h，再次灌胃，此时大鼠血清中药物浓度达到最大。末次灌胃1 h 后，腹腔注射1.2%戊巴比妥麻醉大鼠，碘伏消毒，打开腹腔，游离腹主动脉，套管针取血。将取出的血液立即轻轻注入离心管中，以免溶血，将离心管置于冰盒内静置，1 h后3000 r/min 高速离心机离心20 min。收集同组大鼠血液的上清液，混合均匀，避免个体差异对实验的影响。上清液经56℃水浴灭活30 min，经0.22 μm滤菌器过滤后分装，-20℃冰箱保存备用。②无药血清制备：将中药换成等剂量的生理盐水，灌胃及血清制备方法同上。③胎牛血清从厂家直接购买，超净台内分装后，-20℃冰箱保存备用。

6. 实验检测：细胞传代培养2 d 后，分别用3 组培养液进行细胞换液，继续培养。1 d、2 d、3 d，QRT-PCR 检测补肾活血固齿方对MC3T3-E1 细胞ColⅠmRNA 表达的影响。培养1 d、4 d、7 d、14 d 后透射电镜观察MC3T3-E1细胞超微结构的改变。

7. QRT- PCR 法检测补肾活血固齿方对MC3T3-E1 细胞ColⅠmRNA 表达的影响：①细胞总RNA的提取：低温离心机预冷20 min，每组各取一瓶细胞，倒掉培养基，用PBS 清洗2 遍，培养瓶中加入1 mL Trizol，反复吹打混匀细胞，放入EP 管中，冰上静置10 min，使细胞充分裂解，加入200 μL 氯仿，震荡12 s，冰上静置3 min，EP 管中可见分层，4℃，12000 r/min 离心15 min，吸取上层无色液相加入新的EP管中，新的EP管加入500 μL异丙醇，EP管颠倒混匀，冰上静置10 min，4℃，12000 r/min离心10 min，RNA 沉于管底，为白色小块，EP 管中加入75%乙醇1 mL，振荡EP 管，将沉淀悬浮起来，静置1 min，9000 r/min 离心10 min，晾干EP 管至沉淀变为白色透明状，加入去核酶水20 μL 溶解白色沉淀，吹打混匀，即为提取的总RNA，-20℃冰箱保存。②逆转录反应：分别取各样品5 μg 总RNA，使用逆转录试剂盒进行逆转录反应，所得溶液为cDNA。③扩增反应见表1。④设置反应体系：在0.2 mL PCR8 联管中加入以下试剂，每个样本设置3 个复孔:SYBR Premix Ex Taq II（2×）12.5 μL，PCR Forward Primer（10μm）1 μL，PCR Reverse Primer（10 μm）1 μL，cDNA 2 μL，RNase Free dH2O 补足至25μL，94℃5 min 变性；94℃15 s，59 ℃30 s,72 ℃30 s，40 个循环;95℃15 s，60℃1 min,95 ℃30 s，60℃15 s。⑤相对mRNA 表达水平的计算：本实验采用相对定量公式RQ=2-ΔΔCt法，计算各样本中目的基因的相对定量值（RQ值），将RQ值用于统计分析。⑥统计学方法：应用SPSS19.0 统计学软件进行数据分析，计量资料比较采用F检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 COLⅠ基因及内参基因β-actin的引物序列

8.透射电镜观察MC3T3-E1 细胞超微结构的改变:0.25%的胰酶消化，1000 rpm，离心10 min后制成细胞混悬液，放入EP 管中再次1000 rpm，离心5 min，缓慢加入2.5%戊二醛1 mL，丙酮系列脱水，乙酸异戊脂置换，树脂包埋，制备超薄切片，透射电镜观察细胞超微结构的改变。

结果

1.补肾活血固齿方对MC3T3-E1 细胞Col ⅠmRNA的影响:1 d、2 d、3 d时，无药血清组、胎牛血清组细胞的ColⅠmRNA 表达均无明显差异（P＞0.05）；含药血清组ColⅠmRNA 表达与其他两组相比明显增多（P＜0.05），结果见表2。

表2 MC3T3-E1 细胞ColⅠmRNA的表达

2.补肾活血固齿方对MC3T3-E1 细胞超微结构的影响:MC3T3-E1 细胞经含药血清培养1 d、4 d、7 d、14 d 时观察发现，随着时间的延长MC3T3-E1 细胞细胞质中细胞器逐渐丰富；14 d 时MC3T3-E1 细胞呈成骨细胞样表型，细胞表面突起较多，核呈卵圆形，较大，核膜曲折凹陷；线粒体嵴的密度较大，细胞合成功能旺盛；胞质丰富，胞浆中糖元明显可见；粗面内质网扩张明显，网腔内充满低电子密度絮状物。无药血清组、胎牛血清组细胞的细胞器与含药血清组细胞相比较不丰富，14 d 时MC3T3-E1 细胞表面突起较少（图1）。

图1 MC3T3-E1细胞在3种血清中培养的超微结构

讨论

经过多年的临床观察，肾虚血瘀型牙周炎患者在所有牙周炎患者辨证分型中比例最高，占57.5%，在牙周基础治疗的基础上应用补肾活血固齿方治疗该型牙周炎，既改善局部病损，又调节全身状况，标本兼治，疗效满意[5]。该方剂组成为淫羊藿15 g、补骨脂15 g、熟地黄10 g、当归10 g、丹参10 g、知母10 g、甘草3 g。为探究其作用机制，笔者应用“血清药理学”的实验方法进行了研究，该方法是将实验动物通过灌胃等方式服用药物，药量需换算为实验动物的等效剂量，在一定时间后取动物的含药血清作为药物源进行药理学观察，研究其药用机理,是一种半体内实验方法[15]。在这个过程中中药粗制剂和复杂的成分经过消化已被实验动物吸收、分布，再取含药的血清进行药理实验，比较接近体内环境中药物产生作用的真实过程，适用于复方中药进行药效评价及其作用机制的研究[15]。该方法可有效排除中药制剂自身理化性质对实验的干扰，排除了在体外实验过程中药物与细胞直接作用时某些因素的干扰,客观地模拟了药物与机体相互作用过程,反映中药在胃肠道内的消化吸收、生物转化、产生药效的真实过程，是一种较为科学的中药药理学研究方法，用含药血清进行中药药效作用的观察、研究，增加了中药药理研究的方法和手段，有利于从细胞水平上探讨中药的作用机理[16]。

成骨细胞在骨形成过程中要经历成骨细胞增殖、细胞外基质成熟、细胞外基质矿化和成骨细胞凋亡4 个阶段。在体外培养系统中成骨细胞表型发育与其体内的发育分化较相似，都要经历细胞增殖、细胞外基质成熟和基质矿化3 个时期。胶原蛋白是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，是很多结缔组织的结构蛋白，如皮肤、骨骼、关节和筋腱.胶原蛋白为动物的皮肤、骨骼提供了细胞外框架，增强其强度和柔韧性，并参与组织的形成、成熟、细胞间信息的传递，因此在结缔组织中起着至关重要的作用[17,18]。一些胶原蛋白是成骨细胞分化的标记物，能反映成骨细胞分化表型特征，其中ColⅠ是最普遍的胶原形式，由成骨细胞合成分泌，是细胞外基质的主要成分、羟基磷灰石沉积反应的依托和骨架，是成骨细胞分化的中期指标，其蛋白表达量的高低反应成骨细胞骨形成能力的强弱[19～22]。ColⅠ可以控制骨矿物晶体的形成和发育，这是由于ColⅠ同存在于骨中的矿化胶原纤维形成键进一步结合，成为细胞附着以及钙盐沉着的支架，从而增强骨的韧性[23]，它的合成分泌是骨组织形成的先决条件，加速其合成分泌起到促进骨组织矿化的作用，是成骨细胞向基质成熟方向分化的标志[14]。本实验应用QRT-PCR 技术通过检测ColⅠmRNA 表达量的变化，反应成骨细胞骨形成能力的强弱[24]。

细胞器帮助细胞行使功能，可以反应当下细胞的功能状态。细胞核是真核细胞内最大、最重要的结构，是细胞遗传与代谢的调控中心，是遗传信息的储存、复制和转录的主要场所，在一定程度上控制着细胞的代谢、生长、分化和繁殖等活动，任何有核细胞丢失核后便失去生活机能，并趋于死亡。核膜作为细胞内的界膜，调节细胞核与细胞质之间的物质交换。核膜面积增加代表细胞核与细胞质之间信息交换增加[25～27]。炎症、氧化应激、缺氧等均可引起内质网的功能障碍，使细胞内质网生理功能紊乱，产生亚细胞器病理状态，称为内质网应激，其表现为内质网腔内折叠异常、未折叠蛋白质积累[28]。线粒体增多或线粒体嵴密度增大表明所需能量较多，细胞处于活跃状态。线粒体经过不断的融合和裂变可维持其形态及生理功能[29]。高尔基体作为真核细胞中一种重要的细胞器，参与多种重要的蛋白质，包括与自噬和成骨密切相关的多种蛋白质的合成、加工、分类选择、运输[30]。

本次研究结果显示,于含药血清培养的MC3T3-E1 细胞随着时间的延长细胞质中细胞器逐渐丰富，14 d 时MC3T3-E1 细胞呈成骨细胞样表型；无药血清组、胎牛血清组细胞的细胞器与含药血清组细胞相比较不丰富，14 d 时MC3T3-E1 细胞表面突起较少。1 d、2 d、3 d时，无药血清组、胎牛血清组细胞的ColⅠmRNA 表达均无明显差异；含药血清组细胞ColⅠmRNA 表达与其他2组相比明显增多。表明补肾活血固齿方可能通过增加ColⅠmRNA 的表达，促进MC3T3-E1 细胞向成骨细胞样表型发展，促进成骨细胞分化成熟，而促进骨的形成，对牙周炎的治疗发挥作用。结合前期研究，该方剂可能通过增强MC3T3-E1 细胞中ALP 活性、提高OCN、PDGF、BMP2分泌水平,提高ColⅠmRNA 表达，促进矿化结节的形成等机制，促进MC3T3-E1 细胞向成骨细胞分化成熟，促进骨的形成[5～12]。

笔者前期研究均是在无菌状态下观察补肾活血固齿方对MC3T3-E1 细胞成骨机制的影响，而牙周炎是由菌斑微生物引起的牙周支持组织的慢性感染性疾病，当牙周组织发生炎症时，活化的巨噬细胞能够分泌多种细胞因子参与炎症反应，如白细胞介素（interleukin，IL）和 肿 瘤 坏 死 因 子（tumor necrosisfactor，TNF）等[31]，细胞因子在牙周组织炎症反应中起着重要作用。笔者会在后续的实验中探讨在炎症病理微环境，如用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis）等刺激模拟炎症微环境[32～34]，观察补肾活血固齿方对MC3T3-E1细胞的各种成骨分化蛋白的影响，进一步探讨该方剂的成骨机制。