产胞外多糖乳酸菌的筛选与体外益生特性评价

◎ 李 悦，陈 静，张晓雨，刘 义，韦云路

（1.西南科技大学生命科学与工程学院，四川 绵阳 621000；2.贵州食品工程职业学院，贵州 贵阳 550000）

胞外多糖(EPS)是乳酸菌向周边环境产生的高分子化合物，主要由糖和糖的衍生物组成[1]，长期以来一直被安全地用于食品工业[2]。由于LAB通常被认为是一种安全的食品微生物，纯化的LAB和EPS可以直接用于乳品行业，作为商业乳化剂和增稠剂的替代品，以改善酸奶的黏度、质地和风味[3,4]。然而，虽然人们普遍认识到了LAB与EPS的各种好处，但只有少数产品已经商业化和工业化生产。

分离能够产生活性EPS的天然乳酸菌株，是广泛使用和应用乳酸菌的先决条件。发酵食品大多是由乳酸菌发酵而成，可以作为产胞外多糖乳酸菌的重要来源[5]。研究者发现一种土耳其饮料，以植物乳杆菌为主要菌种，并从天然发酵的青橄榄汁中筛选了17个以上的菌株[6-9]。

研究表明，产生胞外多糖的乳酸菌和发酵剂的结合，可以增加酸奶的黏度和改善口感，而酸奶的黏度主要由形成胞外多糖的数量及结构决定[10-11]。Helen等[12]人提出，产胞外多糖乳酸菌在提高发酵乳硬度方面具有一定效果，且EPS产量越高，制品硬度越小。随着稳定剂在欧洲被禁止使用，出现了不使用添加剂的天然食品[13]。

本研究采用四川特色传统发酵食品腊肉与泡菜作为原材料，筛选并鉴定高产胞外多糖乳酸菌菌株，且对其抗氧化性与自聚集能力进行评价，以期为开展高产胞外多糖乳酸菌的开发与研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料：自然发酵的泡菜、四川农家自制腊肉。

培养基：MRS固体培养基、MRS液体培养基，北京陆桥技术公司。

试剂：胰蛋白酶，北京瑞达恒辉科技发展有限公司；浓硫酸、二甲苯、酚酞、过氧化氢、无水乙醇，成都金山化学试剂。

1.2 仪器与设备

TOMY SX-700立式高压蒸汽灭菌锅：樱美迪生物科技(上海)有限公司；SW-CJ-1F水平流洁净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；SPX-250-B-Z微生物恒温培养箱：上海博讯实业有限公司；UV-5800PC紫外分光光度计：上海元析仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分离、纯化

取5 g产品进行处理，利用梯度稀释将浓度降到10～5。每个梯度于MRS琼脂上涂覆，置于37 ℃培养24～48 h。从平板上选取具有不同特征的单个菌落，对其展开分离和纯化，反复进行以上步骤，直至产生纯菌落,然后将所得的单一菌株进行排序，甘油保藏[14]。

1.3.2 菌株的筛选

1.3.2.1 菌株自聚集实验

参考SON等[15]的方法作适当修改，将乳酸菌菌株5 000 r/min，离心10 min收集，利用PBS缓冲液洗涤菌体2次，PBS缓冲液重悬菌体用测OD600并调至1.0，于37 ℃培养箱中静置2 h，取0.1 mL上层悬液加入1.9 mL的PBS中测定OD600。

1.3.2.2 乳酸菌胞外多糖的提取

根据刘滔[16]和陈东[17]的方法做了修改， 3%接种量接种于MRS中， 37 ℃发酵24 h，离心（5 000 r/min、25 min）取上清液，加入三氯乙酸使其浓度为4 %， 4 ℃静置过夜，离心（5 000 r/min、20 min）取上清液，加入3倍体积无水乙醇， 4 ℃静置过夜，离心（5 000 r/min、20 min）去上清液，用蒸馏水使其溶解，在4 ℃下透析2 d，冷冻干燥，称重量。

1.3.3 菌株的鉴定

（1）乳酸菌的16S rDNA 基因序列测定

由专业公司测序，将测序后获得的16S rDNA基因序列递交美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库；使用搜索工具（BLAST）进行同源性比对，对序列一致性分析[18]。

（2）乳酸菌细胞形态观察

将筛选出的3株乳酸菌培养24 h，随后用革兰氏染色法对目标细菌的形态进行观察。

1.3.4 菌株的体外益生特性

1.3.4.1 DPPH自由基清除率的测定

吸取不同发酵时段的发酵上清液2 mL于10 mL试管中，每支试管加入2 mL 、2×10-4mol·L-1的DPPH溶液，将其振荡均匀，在黑暗处放置30 min，取上清液，测定波长为517 nm的吸光度。实验设空白组、对照组、实验组[19-20]。

式中，A1是DPPH溶液与被测定的液体的吸光度；A2是无水酒精与被测定的溶液的吸光度；A0为DPPH溶液与无水酒精的吸光度值。

1.3.4.2 乳酸菌细胞表面疏水性的测定

利用BATH测定细胞表面疏水性：取菌液5 mL于离心管，离心（3 000 r/min 、10 min）收集菌体。用5 mL的PBS缓冲液清洗两次，以 PBS缓冲液作空白对照，用其调节OD600为1.00 nm，取4 mL于离心管内，添加二甲苯0.8 mL,对照组未添加，震荡30 s后放置10 s,再次震荡30 s，静置10 min待分层。测水相测定OD600nm值[21]。

式中，A0是与二甲苯混合前菌液OD值；A是与二甲苯混匀后菌液 OD值。

2 结果与分析

2.1 分离结果

从四川传统的发酵食品样品中，分离纯化出大约40株的乳酸菌单菌落，其固体培养基的形态，菌株均为白色，形状为圆形，且表面湿润和凸起，可以明显分辨为乳酸菌单个菌落。其中，由泡菜筛选的菌株编号为P1-25，腊肉编号为L1-15，分离到的乳酸菌均采用甘油进行菌株保藏，以备后续试验。

2.2 菌株的筛选及鉴定

2.2.1 菌株的筛选

2.2.1.1 自聚集能力

采用整群随机抽样的方法，从某省某高校二年级学生中选取120名非英语专业大学生为调查对象。其中男生57名，女生63名。

对筛选的乳酸菌进行培养，形成单菌落，初步观察其菌落形态后，选取菌落较大、黏稠的菌株，并进行自聚集能力测定，测定结果显示自聚集率最高的10株乳酸菌，分别为P2、P6、P10、P12、P15、P16、P18、P19、L2、L6（如表1所示）。

表1 菌株自聚集能力表

2.2.1.2 高产胞外多糖乳酸菌的筛选

将2.2.1.1中所得的10株菌进行培养并提取胞外多糖后经真空冷冻干燥，获得的乳酸菌胞外多糖样品颜色为淡黄色或乳白色，结构呈现疏松多孔的形态；对每株菌产生的EPS进行称重，筛选出来的3株高产胞外多糖乳酸菌菌株分别是P2、P6、P19（如表2所示）。

表2 菌株多糖产量表

2.2.2 菌株的鉴定

2.2.2.1 乳酸菌的16S rDNA 基因序列

将从四川传统发酵食品中获得的高产胞外多糖乳酸菌送公司鉴定，结果如表3所示，分别为P2（Leuconostoc mesenteroides）、P6（Lactobacillus sakei）、P9（Weissella viridescens）。

表3 菌株16S rDNA的测序结果表

对3株高产胞外多糖的乳酸菌进行革兰氏染色，结果见图1，所有的细菌都是革兰氏阳性，并且细胞形态呈现长杄、短杄、棒状、球状、细长形，无分枝。

图1 显微镜下菌株细胞形态图

2.3 乳酸菌益生特性

2.3.1 乳酸菌DPPH自由基清除能力

用 DPPH自由基清除速率来评估乳杆菌的抗氧化性。如图2所示，乳杆菌发酵液具有一定的抗氧化活性，数据显示，在乳酸菌的发酵过程中，3株菌的DPPH自由基清除率均随着时间的延长而增长，30 h后，P2和P6有降低趋势，清除率最低的是P2；18 h前，P19的清除能力最强；18h后，P19和P6对DPPH自由基的清除能力相当。

图2 乳酸菌DPPH自由基清除能力图

2.3.2 乳酸菌菌株的表面疏水性

在益生菌的体外筛选过程中，菌体的疏水度反应了菌体在生物体内的定殖能力。本研究分别对筛选到的乳酸菌菌株P2、P6、P19的表面疏水性进行测定，结果由表4可知，各种类型的乳酸菌对二甲苯具有不同的吸附量。其中，P19的疏水率大于90 %，对二甲苯有较好的吸附性；P2、P6两种材料的疏水性均低于50%，对二甲苯的吸附性比较差。

表4 菌株表面疏水性测定结果表

3 讨论

本研究从四川传统的发酵食物泡菜和腊肉中分离出乳酸菌，并且进行筛选，筛选出的乳酸菌单菌落形状与陈东[17]等筛选出的乳酸菌菌落特征一致，初步认定为乳酸菌。在此基础上，本研究对所获取的17株通过自聚集进行筛选，结果表明，这17株乳酸菌的自聚集能力较强，均在90 %以上，说明所筛选的乳酸菌可快速繁殖、自行聚集成团，这一结果与陈孝勇[22]等在牦牛酸乳中选择出的乳酸菌结果相似。随后，本研究对自聚集能力较强的菌株进行胞外多糖产量的测定，得到P2、P6、P19菌株，并运用16S rDNA鉴定菌株，二者16S rDNA序列同源性均大于97.5%，表明二者为同种，这与陈明霞[23]等的研究结果相似。本研究最终筛选出的3株菌在NCBI数据库中进行BLAST相似性对比。其中，P2为Leuconostoc mesenteroides、P6为Lactobacillus sakei、P19为Weissella viridescens。随后将这3株乳酸菌进行革兰氏染色并在显微镜下观察，可以看见明显的紫色，为革兰氏阳性菌，形态观察与16S rDNA鉴定结果一致。

乳酸菌的抗氧化能力能够帮助机体维持相对稳定的状态，本研究表明，3株菌株的自由基清除能力均随着发酵时间增加而增强，30 h后P2和P6有降低趋势。由此可见，选择适当的发酵时间，对于提高乳酸菌的抗氧化能力具有重要作用。

菌体的疏水度反应了菌体在生物体内的定殖能力，本研究中，P19的疏水率大于90 %，P2、P6两种材料的疏水性均低于50%。国内学者从四川传统干酪中筛选得到乳酸菌菌株N-4的疏水性达21.37%，筛选的降胆固醇乳酸菌 ZG2YLu05疏水性为 46.82%[25-26]。与上述研究结果相比，3株菌的优势明显，可见其具有明显的肠道定殖潜力。

4 结语

本研究从四川传统发酵食品中共分离筛选出3株高产胞外多糖乳酸菌，分别是P2、P6、P19，其产量分别为0.140、0.124、0.128 g/L，鉴定为Leuconostoc mesenteroides、Lactobacillus sakei、Weissella viridescens。在益生特性评价中，P2的抗氧化能力较弱，但对DPPH自由基的清除能力最弱；P19和P6抗氧化能力较强，对DPPH自由基的清除能力18 h后相当，18 h前P19的清除能力最强。此外，3株菌的表面疏水性有所不同，其中，P19的疏水率高于90%，这表明3株菌有在肠道定殖的潜力。因此，本研究结果表明，3株菌均有开展益生性能与胞外多糖研究的价值，可以为后续探究奠定基础。