干姜饮片微生物限度检查方法适用性研究

◎ 魏金梅，钟国庆，谢美珍，胡 阳，宋晓园，李桂琴，王 磊

（赣州市综合检验检测院，江西 赣州 341000）

中药饮片的品质决定着中成药的质量，影响着用药患者的健康安全[1]。《中华人民共和国药典（2020年版）》四部通则1107 中对直接口服及泡服饮片的微生物限度标准进行了明确的规定，相较于2015 年版药典对中药饮片的规定，新增了需氧菌总数（限量105CFU·g-1或CFU·mL-1）、霉菌和酵母菌总数（限量103CFU·g-1或CFU·mL-1）等检验项目，此外还规定每1 g 或1 mL供试品中不得检出大肠埃希菌[2]。这表明，我国对中药饮片的质量把控日趋严格，但目前国内仍有许多品种的中药饮片尚未探究出合适的微生物限度检查方法。

干姜是姜科植物姜（Zingiber officinaleRose.）的干燥根茎，味辛，性热，其主要含有挥发油类、姜辣素类等化合物。干姜是药食两用的中药，在食品和医药行业应用广泛，具有抗炎抑菌、抗氧化、保护肝脏和心血管等作用[3]。有研究表明干姜及其提取物姜精油、姜辣素乙醇提取物等具有很好的抑菌效果，其对铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌等具有较明显的抑制作用[4-9]。但目前国内并未对干姜饮片的微生物限度检查方法进行研究。本研究按照《中国药典（2020 年版）》四部通则1107、1108 的要求探究中药饮片干姜的微生物计数及控制菌的检查方法，分析干姜饮片对不同菌株的抑制作用，为干姜饮品的品质把控提供相关理论依据，同时可为含干姜的中成药如透骨镇风丸、定坤丹等的微生物检查提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 菌种

白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、大肠埃希菌[CMCC(B)44102] 和乙型副伤寒沙门菌[CMCC(B)50094]均为定量质控菌，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，经菌种确认验收合格。

1.2 试药

干姜饮片购买于3 家不同连锁药店共3 批药材，产地均为云南，编号1、2、3，具体信息见表1。

表1 3 批干姜饮片信息表

1.3 稀释剂及培养基

pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、胰酪大豆胨液体培养基（TSB）、沙氏葡萄糖液体培养基（SDB）、胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）、肠道增菌液体培养基、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基、麦康凯液体培养基（MB）、RV 沙门菌增菌液体培养基、麦康凯琼脂培养基（MA）以及木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（XLD）均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，经培养基适用性检查验收合格。

1.4 仪器与设备

101-3-BS 型鼓风干燥箱，上海跃进医疗器械厂；BKQ-B10011 型压力蒸汽灭菌器，山东博科生物产业有限公司；SW-CJ-2FD 型洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；BSC-1300IIA2 型生物安全柜，苏州安泰空气技术有限公司；IC613CW 型恒温培养箱，雅马拓科技贸易（上海）有限公司。

1.5 方法

1.5.1 菌液制备

（1）接菌培养，制备新鲜的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌的培养物，取新鲜培养物分别用pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液进行10 倍系列稀释，制成含菌数约为104CFU·mL-1的菌悬液。

（2）取黑曲霉斜面培养物，加入含0.05%（V/V）吐温80的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液3～5 mL，将孢子洗脱，并用pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液进行10 倍系列稀释，制成含孢子数约为104CFU·mL-1的孢子悬液。

1.5.2 供试液的制备

取供试品25 g，用无菌剪刀将其剪碎，置于灭菌三角瓶中，加灭菌TSB 至总体积为250 mL，充分振摇荡洗（不少于15 min），取其液体作为1 ∶10 的供试液。取上述1 ∶10 供试液20 mL，置水浴100 ℃30 min处理后迅速冷却，作为耐热菌总数测定用供试液。

1.5.3 微生物计数方法适用性试验

（1）需氧菌总数、耐热菌总数计数方法适用性试验。试验组：分别取1.5.2 项下制备的1 ∶10 供试液及耐热菌总数测定用供试液9.9 mL，加入1.5.1 项下制备好的5 种试验菌液0.1 mL，充分混匀，使每1 mL供试液中含菌量不大于100 CFU。供试品对照组：分别取1∶10供试液及耐热菌总数测定用供试液9.9 mL，加入胰酪大豆胨液体培养基0.1 mL 以代替菌液，充分混匀。菌液对照组：以胰酪大豆胨液体9.9 mL 替代供试液，加入1.5.1 项下制备好的5 种试验菌液0.1 mL，充分混匀。采用倾注平皿法测定各菌的回收率，取“试验组”的供试液2 mL，每1 mL 倾注于1 个灭菌平皿中。金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌采用TSA 培养基35 ℃培养3 d，白色念珠菌、黑曲霉采用TSA 培养基平板25 ℃培养5 d，计数。按相同方法测定供试品对照组的菌落数及菌液对照组的菌落数，以算术均值作为计数结果。按下列公式计算回收率（比值）。

（2）霉菌和酵母菌总数计数。采用倾注平皿法。取1.5.2 项下制备的1 ∶10 供试液9.9 mL，分别加入1.5.1 项下制备的白色念珠菌菌液0.1 mL 及黑曲霉孢子悬液0.1 mL，充分混匀。取上述混匀的供试液2 mL，每1 mL 倾注至1 个平皿，倾注SDA 培养基，待其凝固后25 ℃培养5 d，计数。供试品对照组的菌落数及菌液对照组的菌落数按同法操作测定，以算术均值作为计数结果，计算回收率。

1.5.4 控制菌检查方法适用性试验

（1）耐胆盐革兰阴性菌（定量试验）检查方法适用性试验。取1.5.2 项下1 ∶10 的供试液在20 ～25 ℃培养约2 h 后，取1 ∶10 供试液进行10 倍系列稀释，稀释成1 ∶100 和1 ∶1 000，取该3 个稀释级样品匀液1 mL，分别接种至10 mL 肠道菌增菌液中，并加入小于100 CFU 的铜绿假单胞菌菌液及大肠埃希菌菌液，作为试验组。依次做阳性对照组和阴性对照组，各组置于35 ℃ 培养48 h，再取培养物划线于XLD 平板上，35 ℃培养24 h，观察结果，进行鉴定实验。

（2）大肠埃希菌检查方法适用性试验。取10 mL 1.5.2 项下制备的1 ∶10 的供试液于100 mL TSB 中，并加入小于100 CFU 的大肠埃希菌菌液，充分混匀，作为试验组，同时做阳性对照和阴性对照组。上述各组按《中国药典（2020 年版）》四部通则1108 中控制菌检查项下大肠埃希菌的检查法进行后续试验及鉴定。

（3）沙门菌检查方法适用性试验。取干姜饮片10 g，用无菌剪刀将其剪碎，加入至100 mL TSB 中，并加入小于100 CFU 的乙型副伤寒沙门菌，充分混匀，作为试验组，同时做阳性对照和阴性对照组。上述各组按《中华人民共和国药典（2020 年版）》四部通则1108 中控制菌检查项下沙门菌的检查法进行后续试验及鉴定。

2 结果与分析

2.1 微生物计数方法适用性试验结果

2.1.1 需氧菌总数、耐热菌总数计数方法适用性试验

需氧菌总数计数方法（1 ∶10）适用性试验结果见表2，耐热菌总数计数方法（1 ∶10）适用性试验结果见表3。实验结果显示，若采用1 ∶10 倾注平皿法测定需氧菌总数，铜绿假单胞菌及枯草芽孢杆菌的回收率不能达到《中华人民共和国药典（2020 年版）》四部0.5 ～2.0 的要求；采用1 ∶10 倾注平皿法进行耐热菌总数的测定时，铜绿假单胞菌的回收率不能达到要求，故将供试液分别稀释至1 ∶50 和1 ∶100 再次进行该项目的方法适用性试验，结果见表4 及表5。结果显示，采用1 ∶50 及1 ∶100 倾注平皿法时，各菌种回收率均能达到0.5～2.0的要求，故可采用1∶50倾注平皿法进行需氧菌总数及耐热菌总数的计数。

表2 需氧菌总数计数方法（1 ∶10）适用性试验结果表

表3 耐热菌总数计数方法（1 ∶10）适用性试验结果表

表4 需氧菌总数计数方法（1 ∶50/1 ∶100）适用性试验结果表

表5 耐热菌总数计数方法（1 ∶50/1 ∶100）适用性试验结果表

2.1.2 霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验

霉菌和酵母菌总数计数方法（1 ∶10）适用性试验结果见表6。结果显示，霉菌和酵母菌总数的测定采用1 ∶10 倾注平皿法测定时，各试验菌的回收率（比值）均在0.5 ～2.0，此方法可行。

表6 霉菌和酵母菌总数计数方法（1 ∶10）适用性试验结果表

2.2 控制菌检查方法适用性试验结果

2.2.1 耐胆盐革兰阴性菌（定量试验）检查方法适用性试验

耐胆盐革兰阴性菌（定量试验）检查方法适用性试验结果见表7。由表7 可知，采用10 mL 肠道菌增菌液体培养基进行试验时，铜绿假单胞菌试验组未检出，故此方法不可行。采用增加肠道菌增菌液体培养基的方法再次进行试验，将该培养基体积增至15 mL，阴性对照组未检出试验菌，而试验组及阳性对照组均可检出，表明此方法可行。

表7 耐胆盐革兰阴性菌（定量试验）检查方法适用性试验结果表

2.2.2 大肠埃希菌、沙门菌检查方法适用性试验

大肠埃希菌、沙门菌检查方法的适用性试验结果见表8。由表8 可知，采用100 mL TSB 培养基进行增菌培养适用于大肠埃希菌的检查，但沙门菌的检查采用同体积TSB 时试验组无法检出沙门菌，故该法不适用于干姜饮片沙门菌的检查。因而采用增加胰酪大豆胨液体培养基的方法重新进行试验。将10 g 干姜饮片用无菌剪刀将其剪碎，加入200 mL TSB 中进行沙门菌检查方法适用性试验。结果阴性对照组未检出沙门菌，而试验组及阳性对照组均可检出此菌，表明使用200 mL TSB 培养基进行增菌培养适用于干姜饮片沙门菌的检查。

表8 大肠埃希菌、沙门菌检查方法的适用性试验结果表

综上所述，采用1 ∶10 平皿法进行需氧菌总数计数时，枯草芽孢杆菌的回收率以及铜绿假单胞菌的回收率不能达到要求，需稀释至1 ∶50 才能满足回收率0.5 ～2.0 的要求。采用1 ∶10 平皿法进行耐热菌总数计数时，铜绿假单胞菌的回收率不能达到要求，需稀释至1 ∶50 才能满足要求。耐胆盐革兰阴性菌检查使用10 mL 肠道增菌液时，铜绿假单胞菌试验组无法检出，需使用15 mL 肠道增菌液进行增菌培养。沙门菌检查使用100 mL TSB 时试验组无法检出沙门菌，需增加该培养基至200 mL。因此，确定干姜饮片的微生物限度检查方法如下。①需氧菌总数及耐热菌总数计数采用1 ∶50 倾注平皿法。②采用1 ∶10 倾注平皿法进行霉菌和酵母菌总数的测定。③耐胆盐革兰阴性菌分别取相当于0.1 g、0.01 g 和0.001 g 供试品的预培养物接种至15 mL 肠道菌增菌液体培养基中进行检查。④大肠埃希菌检查取相当于1 g 供试品的供试液加入至100 mL TSB 中进行增菌培养。⑤沙门菌检查将10 g 样品加至200 mL TSB 中进行增菌培养。

2.3 干姜饮片的抑菌性分析

从本研究试验结果可知，干姜饮片对铜绿假单胞菌及枯草芽孢杆菌具有较强的抑菌性，且对金黄色葡萄球菌也有一定的抑制作用。有文献报道，新鲜生姜和干姜的精油对铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌等均有抑菌效果[[4-5]]，EL-BAROTY 等[6]发现，姜精油对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌有良好的抑制作用。另有文献报道，姜产品对上述3 种菌均有抑制作用[7]，这些研究结论与本实验结果有相通之处，或可用于解释干姜饮片对上述菌株的抑菌作用。干姜的抑菌作用可能源于其精油或姜辣素等成分的抑菌效果[8-9]。干姜对沙门菌的抑制作用[10]，在本研究中也得到了验证。有研究表明，姜皮精油对大肠埃希菌具有抑制作用[11]，本实验未发现干姜对大肠埃希菌有抑菌作用，考虑是按药典的规定，检测大肠埃希菌时加入的样品量为1 g，该样品量不足以对大肠埃希菌产生抑菌性。本实验未发现干姜对白色念珠菌及黑曲霉有抑制作用。

3 结论

干姜饮片药食两用，应用广泛。药理学研究表明，干姜及其单体化学成分具有抗炎抑菌、抗氧化、抗癌、保护肝脏、心血管等作用[3]。本研究探究出了适合干姜饮片的微生物限度检查方法，并在此基础上分析了干姜饮片对不同菌株的抑制作用，这有益于干姜饮片的质量控制，同时可为含干姜饮片的中成药如透骨镇风丸、定坤丹等的微生物限度检查提供一定的参考。