氢化珊瑚钙的复配修饰及抗氧化增效作用研究

成 昭,徐 玥,梁 飞,郑 蕾,何 昊,李 根

(1.西安医学院药学院,陕西 西安 710021;2.西安莱伯瑞生物工程有限公司,陕西 西安 710116)

机体代谢过程中产生的活性自由基,广泛参与生命体内的各种氧化-还原反应[1-2]。自由基氧化应激学说认为,氧化-还原路径中的自由基处于动态平衡,自由基过量时,可能引发氧化-还原反应失衡[3-5],从而导致自由基在机体内过量积累,进而攻击细胞与结缔组织,造成细胞损伤[6-7],引发组织与器官功能紊乱,致使机体衰老。为了维持生命体内自由基的动态代谢平衡,机体依赖于各种抗氧化剂完成自由基清除。其中,具有还原性的小分子氢能够有效结合氧化路径中相关自由基,如羟基自由基等;同时,还原性氢具有快速透皮及快速转运特性,可加快机体代谢速度,达到抗氧化、抗衰老的功效[8-10]。天然来源的珊瑚钙,能够以其微孔结构进行氢储存[11-12]。储氢珊瑚钙作为一种微孔氢缓释材料,能够延长还原性氢的使用间隔与有效适用时间,保证经缓释路径给出的微量氢被充分利用,为研究人员开发微孔释氢的抗氧化材料提供了新思路。

在此,作者通过对天然微孔材料珊瑚钙进行储氢与活化,制备氢化珊瑚钙,并分别与硼氢化锂(LiBH4)、辅酶Q10(Q10)、抗坏血酸(VC)等抗氧化性组分进行复配,制备复配氢化珊瑚钙,对其释氢、抗氧化增效及细胞毒性进行研究。

1 实验

1.1 试剂与仪器

碳酸钙、氢化钙、珊瑚钙、锌粒、硫酸(70%)、硼氢化锂(LiBH4)、辅酶Q10(Q10)、抗坏血酸(VC)、DPPH试剂(2,2-联苯基-1-苦基肼基)、氯化硝基四氮唑蓝(MTT),化学纯;N,N-二甲基亚砜(DMSO),色谱纯,上海阿拉丁生化科技公司。

UV-1700型紫外可见分光光度计,日本岛津制作所;STA200型热重法-差示扫描量热法同步热分析仪,日本日立制作所;U-LH 100 hG IX73型倒置荧光显微镜,日本奥林巴斯公司;1510 Mwltiskan Go型多功能酶联检测仪,美国赛默飞世尔科技有限公司。

1.2 氢化珊瑚钙及复配氢化珊瑚钙的制备

精密称取0.005 0 g珊瑚钙,通过足量锌粒与稀硫酸的制氢反应,同步实现制氢与珊瑚钙储氢过程,充分反应4 h,得到氢化珊瑚钙。

分别称取氢化珊瑚钙及抗氧化性组分LiBH4、Q10、VC各0.005 0 g,进行等质量复配,30 ℃搅拌下充分反应4 h,得到复配氢化珊瑚钙,即氢化珊瑚钙-LiBH4、氢化珊瑚钙-Q10、氢化珊瑚钙-VC。

1.3 热重分析

称取氢化珊瑚钙5 mg,在氮气氛围下,以20 ℃·min-1的速率进行升温,在30～795 ℃范围内测定氢化珊瑚钙的热重曲线,分析其储氢含量与氢缓释性能[13-15]。

1.4 紫外可见吸收光谱分析

出射狭缝与入射狭缝宽度均为1 nm,扫描波段为350～600 nm,测定珊瑚钙、释氢活性物质氢化钙[8]、氢化珊瑚钙及其复配物的紫外可见吸收光谱,分析复配氢化珊瑚钙的特征光谱吸收,进一步通过DPPH自由基清除实验研究复配物的抗氧化增效作用。

1.5 体外细胞毒性实验

采用MTT法测定氢化珊瑚钙及复配氢化珊瑚钙的体外细胞毒性。取对数生长期的人肝癌细胞株HepG2,配制密度为5×104个·mL-1的细胞悬液,加入到96孔板中,使每孔细胞数约8 000～10 000个,将梯度浓度(1 000、500、250、125、62.5、31.25,μg·mL-1)的氢化珊瑚钙及复配氢化珊瑚钙溶液依次加入到96孔板中,溶剂对照为0.1%DMSO,每组设置2个平行孔;将孔板置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中,培养24 h。实验终止前,每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg·mL-1),培养4 h,弃去培养液;然后每孔加入150 μL DMSO,测定490 nm处吸光度(OD),按下式计算HepG2细胞增殖抑制率(%):

2 结果与讨论

2.1 氢化珊瑚钙的储氢含量

测定30～795 ℃范围内氢化珊瑚钙的热重曲线,并对失重率进行进一步分析,得到释氢失重曲线,结果见图1。

图1 氢化珊瑚钙在30～795 ℃(a)、33.75～52 ℃(b)范围内的热重曲线Fig.1 Thermogravimetric curves of coral calcium hydride in range of 30-795 ℃(a) and 33.75-52 ℃(b)

由图1可知,氢化珊瑚钙在52～563 ℃范围内无其它失重;563 ℃后,珊瑚钙骨架逐渐坍塌(图1a)。氢化珊瑚钙的释氢失重段处于33.75～52 ℃范围内(图1b),其储氢含量约为0.02%。

2.2 复配氢化珊瑚钙的紫外可见吸收光谱(图2)

图2 单组分(a)、复配珊瑚钙(b)、复配氢化钙(c)及复配氢化珊瑚钙(d)的紫外可见吸收光谱Fig.2 UV-Vis absorption spectra of single components(a),complexed coral calcium(b),complexed calcium hydride(c),and complexed coral calcium hydride(d)

由图2可知,珊瑚钙、氢化钙、氢化珊瑚钙及其复配物均保持基本一致的紫外可见吸收,珊瑚钙及其复配物的吸收峰集中于519 nm(图2b),而具有释氢活性的氢化钙及其复配物、氢化珊瑚钙及其复配物的吸收峰集中于427～429 nm(图2c、d);经过储氢活化过程,氢化珊瑚钙与珊瑚钙的特征吸收峰分别位于427 nm、519 nm处,位置差异显著;氢化珊瑚钙的特征吸收峰与释氢活性物质氢化钙(λmax=428 nm)具有一定的相似性;此外,复配氢化珊瑚钙的吸收峰强度出现差异,主要是由于,氢化珊瑚钙释氢效应对单组分LiBH4、Q10、VC的抗氧化增效作用不同。经储氢与活化,制备的氢化珊瑚钙表现出与释氢活性物质氢化钙相似的光学吸收,初步证明氢化珊瑚钙具有一定的释氢效果。

2.3 复配氢化珊瑚钙对DPPH自由基的清除能力及抗氧化增效作用

基于复配氢化珊瑚钙对516 nm处DPPH自由基特征吸收峰的抑制作用,评价复配氢化珊瑚钙的氢缓释、自由基清除与抗氧化性能[16-17]。通过紫外可见吸收光谱法分别测定复配珊瑚钙、复配氢化钙及复配氢化珊瑚钙对DPPH自由基的清除能力,结果见图3。

图3 复配珊瑚钙(a)、复配氢化钙(b)及复配氢化珊瑚钙(c)的抗氧化性能Fig.3 Antioxidation performance of complexed coral calcium(a),complexed calcium hydride(b),and complexed coral calcium hydride(c)

由图3可知,复配珊瑚钙的紫外可见吸收光谱的吸收峰位置、峰形均与对照组DPPH自由基无明显差异,仅吸收峰强度略有降低(图3a),说明复配珊瑚钙与抗氧化性组分的抗氧化性能并无明显差异[18-19],抗氧化性组分LiBH4、Q10、VC具有一定的DPPH自由基清除能力,但珊瑚钙并未对上述组分产生抗氧化增效作用。而复配氢化钙、复配氢化珊瑚钙的紫外可见光谱的吸收峰位置、峰形、峰强度均与对照组DPPH自由基具有显著差异(图3b、c),氢化钙及氢化珊瑚钙的释氢效果有效提高了LiBH4、Q10、VC的抗氧化性,表现为复配氢化钙及复配氢化珊瑚钙对DPPH自由基的显著清除能力及抗氧化增效作用,且复配氢化珊瑚钙的抗氧化增效作用更优。具有释氢功效的复配氢化珊瑚钙与抗氧化性组分的抗氧化性有显著差异,进一步证明了氢化珊瑚钙的活性氢缓释作用能够实现快速转运、有效清除DPPH自由基,实现LiBH4、Q10、VC的抗氧化增效。

2.4 复配氢化珊瑚钙的细胞毒性评价

测定氢化珊瑚钙及复配氢化珊瑚钙在不同浓度下对体外HepG2细胞的24 h细胞毒性,结果见图4。

图4 氢化珊瑚钙及复配氢化珊瑚钙对HepG2细胞的24 h细胞毒性Fig.4 Cytotoxicity of coral calcium hydride and complexed coral calcium hydride on HepG2 cells at 24 h

由图4可知,在梯度浓度(1 000、500、250、125、62.5、31.25,μg·mL-1)下,氢化珊瑚钙及复配氢化珊瑚钙对体外HepG2细胞的增殖抑制作用均不显著,最大作用浓度1 000 μg·mL-1下,细胞增殖抑制率低于10%,说明经天然来源物质修饰得到的氢化珊瑚钙具有低毒性,对体外HepG2细胞毒性较低。

3 结论

通过对天然微孔材料珊瑚钙进行储氢与活化,得到氢化珊瑚钙,并分别与LiBH4、辅酶Q10、抗坏血酸等抗氧化性组分进行复配,得到复配氢化珊瑚钙。热重分析结果表明,氢化珊瑚钙具有一定释氢效果,其释氢失重段处于33.75～52 ℃,储氢含量约为0.02%。紫外可见吸收光谱分析结果表明,一方面,氢化珊瑚钙表现出与释氢活性物质氢化钙相似的紫外可见吸收;另一方面,复配氢化珊瑚钙因活性氢缓释与DPPH自由基清除性能的协同效应,实现了对硼氢化锂、辅酶Q10、抗坏血酸的抗氧化增效作用,证明了复配氢化珊瑚钙的活性氢缓释性能与抗氧化性能。此外,复配氢化珊瑚钙对体外HepG2细胞呈低毒性,是一种生物友好的微孔释氢与抗氧化材料,对于活性氢的抗氧化功效与机制分析、机体抗衰老等相关研究具有重要意义。