赤霉素GA4提取工艺研究

肖 江,聂志奎,周圣骄,刘 杰,聂 波,廖海兵,胡腾飞

(江西新瑞丰生化股份有限公司,江西 新干 331300)

植物生长调节剂是一种与植物激素具有相似生理和生物学效应的物质,可以有效调节作物的生长发育过程,达到稳产增产、改善品质、提高作物抗逆性等目的[1-3]。作为目前使用最广泛的植物生长调节剂之一,赤霉素(GAs)参与许多植物的生长发育过程[4-5]。赤霉素是一类双萜类化合物,目前已发现136种不同结构的赤霉素类化合物[6],而不同结构的赤霉素可以调节植物不同部位的生长。如GA3主要调节植物茎叶的生长,且生物活性最强;GA4主要对植物果实细胞的伸长调节作用最明显,在一定程度上打破某些植物种子的休眠、提高座果率、防止果裂和果锈等;GA7主要用于核果类植物的开花期,调节植物的开花数量,从而保证果实质量[7-8]。GA4是农业生产中一种非常重要的植物调节剂,目前GA4主要通过微生物发酵生产,但发酵液中含有大量难以去除的有机杂质,造成GA4提取困难。鉴于此,作者开发一种新的GA4提取工艺,为工业化生产GA4开辟一条廉价环保的途径。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

GA4发酵液,江西新瑞丰生化股份有限公司;ZX-767型针剂用活性炭,江苏竹溪活性炭有限公司。

“1231”破乳剂(含量≥99.0%),安徽奔马先端科技有限公司;乙酸乙酯(质量分数≥99.0%,其中乙醇质量分数≤0.5%),工业级;乙醇(体积分数≥95.0%),工业用二级;盐酸(质量分数≥31.0%),工业用合格品。

RE-300A型旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂;LC-20型全自动液相色谱仪,岛津;NFS8040-30/10型一级浓缩纳滤膜设备;增强聚丙烯压滤机,浙江荣源环境科技股份有限公司。

1.2 GA4的提取

用液碱调节GA4发酵液的pH值至6.5～7.0,经过板框过滤,浓缩液水洗后再次经过板框过滤,合并滤液;滤液经过分子截留量为5×104～8×104的卷式超滤膜,浓缩约60倍;超滤浓缩液经过反渗透卷式膜进行快速低倍浓缩,浓缩约2～3倍,得到反渗透浓缩液;按0.8∶1比例将乙酸乙酯加入到反渗透浓缩液中,开启搅拌,调节pH值至4.2～4.6,并加入约0.15%的“1231”破乳剂,搅拌,离心分离后得到萃取液;取2.0 L左右萃取液置于旋转蒸发仪中,真空浓缩(温度50 ℃左右、真空度在-0.08 MPa以下),待乙酸乙酯全部蒸干后,迅速加入200 mL乙醇,加热至50 ℃左右;再加入5%的活性炭,搅拌,并保持料液温度在40 ℃左右,搅拌0.5 h,过滤,得到脱色液;缓慢加入脱色液3倍体积的去离子水,静置0.5 h后,过滤,干燥,即得GA4结晶粉末。

1.3 GA4效价的测定

1.3.1 溶液的配制

标准溶液的配制:称取GA4标准品0.025 g于容量瓶中,用少量甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,即得标准溶液。

样品溶液的配制:称取GA4结晶粉末样品0.025 g于烧杯中,用少量甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,即得样品溶液。

1.3.2 色谱条件

ODS-C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为甲醇-水-甲酸(体积比67∶33∶0.05),使用前超声波脱气;流速0.75 mL·min-1;检测波长210 nm;进样量20 μL。

1.3.3 GA4效价的计算

待高效液相色谱仪基线稳定后,连续注入数针标准溶液,计算各针相对响应值的重复性,待相邻两针的相对响应值变化小于1.5%时,按标准溶液、样品溶液、样品溶液、标准溶液的顺序进行测定。按式(1)计算GA4效价(X):

(1)

1.4 GA4收率的计算

按式(2)计算GA4收率:

(2)

2 结果与讨论

2.1 不同萃取液体积下的结晶效果(表1)

表1 不同萃取液体积下的结晶效果Tab.1 Crystallization effect under different volumes of extract liquid

从表1可以看出,针对不同体积的萃取液,该提取工艺具有普适性,但对于不同体积的萃取液,GA4收率有一定差距,可能是由于GA4提取工艺未优化到最佳。

2.2 GA4提取工艺优化

2.2.1 活性炭加量对GA4收率的影响(表2)

表2 活性炭加量对GA4收率的影响Tab.2 Effect of activated carbon dosage on GA4 yield

从表2可以看出,当活性炭加量为5%时,GA4收率最高。因此,最佳活性炭加量为5%。

2.2.2 水加量对GA4收率的影响(表3)

表3 水加量对GA4收率的影响Tab.3 Effect of water dosage on GA4 yield

从表3可以看出,随着水加量的增加,GA4收率先逐渐升高后略有降低;当水加量V水∶V脱色液增至(2～3)∶1时,GA4收率较为稳定,保持在71%左右。因此,最佳水加量V水∶V脱色液为(2～3)∶1。

2.2.3 结晶时搅拌对GA4收率的影响(表4)

表4 结晶时搅拌对GA4收率的影响Tab.4 Effect of stirring during crystallization on GA4 yield

从表4可以看出,结晶时开启搅拌,GA4收率为73.8%;而不开启搅拌时,GA4收率仅68.0%。

综上,确定GA4最佳提取工艺为:活性炭加量为5%、水加量V水∶V脱色液为(2～3)∶1、结晶时开启搅拌,在此条件下,GA4收率达到73.8%。

2.3 传统提取工艺评价

GA4的传统提取工艺流程为:GA4发酵液经过前处理后,蒸出大部分乙酸乙酯,再加入正丙醇和N-甲基苄胺,生成N-甲基苄胺盐沉淀;将N-甲基苄胺盐分离后用甲醇溶液溶解,加酸、加水使GA4结晶析出。不同萃取液体积下传统提取工艺的试剂加量及结晶效果见表5。

表5 不同萃取液体积下传统提取工艺的试剂加量及结晶效果 Tab.5 Reagent dosage and crystallization effect of traditional extraction process under different volumes of extract liquid

比较表1、表5数据可以看出,相同体积的萃取液,采用传统提取工艺时的GA4收率略高于采用新提取工艺时的;但传统提取工艺不仅需要使用价格昂贵的N-甲基苄胺、正丙醇、草酸等试剂,还涉及到成盐化学反应,工艺冗长且复杂[9],难以满足工业化生产需求[10-12]。

3 结论

开发了一种新的GA4提取工艺,该工艺流程为:GA4发酵液经过前处理后,再经过板框过滤、超滤和反渗透浓缩后得到反渗透浓缩液;用乙酸乙酯进行萃取分离,将GA4转入到有机相再进行真空浓缩,将乙酸乙酯全部蒸出后,再转入乙醇,加入活性炭搅拌进行脱色处理;加入去离子水进行重结晶,过滤,干燥,得到GA4结晶粉末。该提取工艺避免了繁琐的操作步骤,有机溶剂使用量少,成本低,更加环保和绿色,适用于GA4的工业化生产。