磁共振功能成像评价宫颈鳞状细胞癌乏氧微环境

卢佳翔，栾一祎，秦凤英，孙丽丽，徐宏明，于韬，董越*

1.大连医科大学附属肿瘤医院，辽宁省肿瘤医院放射科，辽宁 沈阳 110041；2.辽宁省肿瘤医院病理科，辽宁 沈阳 110041；3.大连理工大学，辽宁 大连 116081；*通信作者 董越 dyy1026@sina.com

宫颈癌在全球女性癌症发病率中居第4位，2020年新增病例约60.4万例，新增死亡数约34.2万例[1]。宫颈鳞状细胞癌（cervical squamous cell carcinoma，CSCC）是宫颈癌的主要病理亚型[2]，缺氧是其发生及发展的不利因素之一，可刺激肿瘤血管化、促进肿瘤侵袭和转移，也是肿瘤耐药的主要原因[3]。缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）作为组织缺氧的内在标志物，可通过检测其表达水平评估组织的氧合状态，其异常表达与宫颈癌的发生与发展密切相关[4-5]。动态对比增强磁共振（ dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging，DCE-MRI）能定量评估肿瘤微环境，包括血管的通透性、流动性、异质性及空间分布，已广泛应用于肿瘤缺氧的评价[6-7]。扩散加权成像（DWI）通过检测组织中水分子扩散及运动受限的程度，间接反映组织微观结构。DWI能提供肿瘤微循环灌注方面的信息，可作为反映肿瘤血管生成指标的替代参数[8]。研究表明DWI的相关参数可以区分CSCC的良恶性区域、判断组织学分级及淋巴结转移情况[9-10]，但少有研究关注DWI相关参数与免疫组化乏氧指标的相关性。本文旨在研究CSCC DCE-MRI定量参数[转移常数（Ktrans）、组织间隙-血浆速率常数（Kep）、细胞外血管外血浆容积分数（Ve）]、DWI参数表观扩散系数（ADC）值与反映宫颈癌乏氧状态的指标HIF-1α表达的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 回顾性选取辽宁省肿瘤医院2014年12月—2017年8月宫颈癌患者，所有患者在术前接受MRI扫描。纳入标准：①临床、影像资料完整；②可行病理免疫组化；③行MRI检查前无宫颈癌相关治疗史。排除标准：①非CSCC患者；②无法获得准确的动脉血管输入函数曲线、MRI图像质量不佳；③病理切片不能满足评估要求。共纳入81例患者，年龄28～65岁，平均（49.8±9.3）岁。根据2009国际妇产科联盟分期[11]分为：IB期53例（65.43%），ⅡA期27例（33.33%），ⅡB期1例（1.24%）。本研究经本院伦理委员会批准（20210825YG），所有患者或家属均签署知情同意书。

1.2 检查方法 使用Siemens Magnetom Trio 3.0T MRI，8通道体部相控阵线圈，扫描范围为整个骨盆。行常规MRI平扫、DWI和DCE-MRI检查。b值分别为0、1 000 s/mm2。DCE-MRI采集30个序列，480幅图像，时间分辨率为10 s，总扫描时间约5 min。具体扫描参数见表1。

表1 本研究MRI扫描参数

1.3 图像分析 由1位具有2年工作经验的放射住院医师使用GE Omni Kinetics软件对DCE-MRI和DWI数据进行处理，1位高年资主任医师指导监督。DCE-MRI数据采用Extended Tofts Liner双室模型进行后处理，首先按顺序导入2°和15°翻转角度的数据，选择宫颈癌3个最大层面的左或右髂外动脉获得动脉函数输入曲线；然后参考原始DCE-MRI图像，在原发肿瘤最大层面手动勾画感兴趣区（ROI），尽可能覆盖全部肿瘤区域并避开显著坏死区域，通过软件计算DCE-MRI定量参数（Ktrans、Kep和Ve）的平均值[12]。参考横轴位T2WI及DWI（b=0 s/mm2）图像，在ADC图上对肿瘤原发灶手动勾画ROI，尽可能覆盖原发灶，避免将病灶明显坏死区画入ROI，得到病灶ADC值。选取连续3个病灶最大层面进行测量，最终取平均值纳入后续研究。

1.4 病理学检查 标本切片按说明书用SP法免疫组化染色，试剂为鼠抗人HIF-1α单克隆抗体（北京中杉金桥生物有限公司），DAB染色液（上海基因科技股份有限公司）。免疫组化评分由一位病理诊断医师判定结果，一位高年资主任医师进行监督。HIF-1α阳性表达表现为肿瘤细胞内出现棕黄色颗粒，且大多数定位于肿瘤细胞的细胞质，少数定位于细胞核。HIF-1α表达：每张切片选取癌细胞数目较多的5个高倍视野（×400），在每个视野中计数100个细胞。染色强度：0分：无着色，1分：淡黄色，2分：棕黄色，3分：棕褐色或黑色。阳性细胞百分比：0分：无阳性细胞；1分：＜30%；2分：30%～70%；3分：＞70%。将每张切片所得的染色强度与阳性细胞百分比相乘得到评分结果[13]。评分≤4分为低表达，评分＞4分为高表达。

1.5 统计学方法 使用SPSS 25.0 软件。采用Kolmogorov-Smirnov检验判断计量资料是否符合正态分布，不符合正态分布者以M（Q1，Q3）表示，两组间比较采用Mann-WhitneyU检验，多组间比较采用Kruskal-Wallis检验；计数资料以例数表示。采用非参数Spearman相关性检验评价DCE-MRI、DWI参数与HIF-1α表达的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HIF-1α表达情况 HIF-1α表达：0分12例，1分2例，2分11例，3分6例，4分18例，6分25例，9分7例。低表达49例，高表达32例。

2.2 HIF-1α表达与病理特征的关系 CSCC患者在有无淋巴结转移、有无脉管癌栓、间质浸润深度、分化程度组间HIF-1α表达差异有统计学意义（P均＜0.01）。有淋巴结转移、脉管癌栓，间质浸润深度越深和分化程度越低的患者，HIF-1α表达越高，见表2。

表2 81例宫颈癌患者HIF-1α表达与病理指标的关系［M（Q1，Q3）］

2.3 DCE-MRI、DWI参数与病理特征的关系 CSCC患者有无淋巴结转移组间的Ktrans差异有统计学意义（P＜0.01），有淋巴结转移者Ktrans值高于无淋巴结转移者。其余DCE-MRI及DWI参数在有无淋巴结转移、有无脉管癌栓、间质浸润深度、分化程度组间差异无统计学意义（P均＞0.05），见表3。

表3 81例宫颈癌患者DCE-MRI、DWI参数与病理指标的关系［M（Q1，Q3）］

2.4 HIF-1α表达与DCE-MRI、DWI参数的相关性HIF-1α表达与Ktrans、Kep呈正相关（r=0.478、0.388，P＜0.01），与Ve、ADC值无相关性（图1、2）。

图1 女，56岁，宫颈癌ⅡA期，有淋巴结转移及脉管癌栓，间质浸润深度≥1/2，低分化。A.轴位T2WI图显示CSCC病灶（箭）；B. Ktrans伪彩图勾画病灶范围（箭），Ktrans平均值0.916/min；C. Kep伪彩图勾画病灶范围（箭），Kep平均值1.421/min；D. Ve伪彩图勾画病灶范围（箭），Ve平均值0.666/min；E. ADC图勾画病灶范围（箭），ADC平均值0.829×10-3 mm2/s；F. HIF-1α免疫组化（×400）示HIF-1α高表达，评分9分

图2 女，58岁，宫颈癌ⅡA期，无淋巴结转移及脉管癌栓，间质浸润深度≥1/2，中分化。A.轴位T2WI图显示CSCC病灶（箭）；B. Ktrans伪彩图勾画病灶范围（箭），Ktrans平均值0.393/min；C. Kep伪彩图勾画病灶范围（箭），Kep平均值0.851/min；D. Ve伪彩图勾画病灶范围（箭），Ve平均值0.461/min；E. ADC图勾画病灶范围（箭），ADC平均值0.736×10-3 mm2/s；F. HIF-1α免疫组化（×400）示HIF-1α低表达，评分4分

3 讨论

3.1 HIF-1α表达与病理特征的关系 本研究发现有淋巴结转移及脉管癌栓、浸润程度深、肿瘤分化程度越低的CSCC HIF-1α表达越高，与皮国良等[14]对食管鳞癌的研究结果一致。HIF-1α在缺氧条件下稳定存在于细胞核，当其与HIF-1β亚基形成异源二聚体HIF-1后可与靶基因的缺氧反应元件序列结合，使下游多种靶基因的表达受到影响，包括血管内皮生长因子、葡萄糖转运蛋白、碳酸酐酶9等，可使肿瘤适应缺氧，控制血管生成与红细胞生成，增加肿瘤侵袭及迁移能力。有研究[15]表明低分化组和淋巴结转移组HIF-1α表达率更高，且HIF-1α可以促进肿瘤的侵袭和转移，同时促进肿瘤相关血管生成，使肿瘤细胞存活并提高肿瘤细胞的增殖率。因此，有淋巴结转移及脉管浸润的CSCC患者HIF-1α表达更高。而肿瘤低分化及间质浸润程度深的CSCC病灶恶性程度更高，肿瘤细胞的增殖速度较快，肿瘤区域内的异质性更显著，乏氧情况更明显，HIF-1α表达更高。

3.2 HIF-1α与DCE-MRI参数的相关性 本研究发现HIF-1α表达与DCE-MRI定量参数Ktrans、Kep呈正相关，与Ve无明显相关性，与何承峻等[16]对肝癌、刘萌等[17]对鼻咽癌的研究结果一致，可能的原因是肿瘤乏氧时HIF-1α高表达，HIF-1α及其激活的下游转录因子调控肿瘤新生血管，大量原始新生血管形态各异，走行不规则，基底膜和内皮不完整或缺失[18]，缺乏周细胞和平滑肌细胞覆盖，使肿瘤血管的渗透性更高，以上均可以导致Ktrans和Kep值升高。Hauge等[19]发现与Ve相比，Ktrans与宫颈癌乏氧分数的相关性更高。根据Tofts广义药代动力学模型，Ve是造影剂分数分布体积的量度。分数分布体积由血管外细胞外体积分数和细胞外基质的范围决定，若细胞外基质稀疏，血管体积小，Ve主要由细胞外体积分数决定，从而直接反映细胞密度。然而，宫颈癌会形成致密的富含胶原蛋白的细胞外基质，并且在血管密度方面表现出显著的肿瘤间异质性，因此Ve不能很好地反映肿瘤的乏氧状态。

Li等[20]对宫颈癌研究发现，Ktrans、Kep与HIF-1α的表达成反比，该研究认为Ktrans由血液灌注和血管通透性表面积乘积决定，而Ktrans的差异主要由血液灌注的差异影响，血管通透性的影响可以忽略不计。也有可能是因为新生肿瘤血管缺乏血管运动和流量调节，血流速度不稳定，流动方向也可能不同，从而得出与本研究不同的结论。

3.3 HIF-1α与DWI参数的相关性 本研究中HIF-1α表达与ADC值无相关性。Li等[20]对宫颈癌研究发现HIF-1α表达与ADC值呈负相关，在胆管癌[21]、前列腺癌[22]等研究中也有类似的发现，可能的原因是在肿瘤生长过程中，缺氧可能抑制肿瘤细胞生长或导致肿瘤细胞死亡，其中水分子扩散程度可能减少，使ADC值降低；也可能是低ADC值表明肿瘤的间质丰富及血流灌注不良，这与HIF-1α高表达和肿瘤恶性程度有关。然而，Huang等[23]对肝癌研究发现HIF-1表达与ADC值呈正相关，推测缺氧可能通过早期衰老细胞收缩和衰老过程中细胞丧失导致细胞外水分子的流动性增加，从而使ADC值增加。

3.4 本研究的局限性 ①肿瘤病理组织的取材不能完全与MRI测量层面对应。②选择最大层面进行人工操作勾画ROI存在一定偏倚，且肿瘤组织异质性信息可能未全部体现。③本研究为回顾性研究，样本量较小，还需要大样本前瞻性研究进一步验证。

总之，HIF-1α作为分子病理生物学标志物，在具有更高侵袭性和淋巴结转移的CSCC中高表达，反映出恶性程度更高的肿瘤组织乏氧更明显的病理学特征。DCE-MRI定量参数能够使CSCC的乏氧特征可视化，其定量参数可以对肿瘤乏氧微环境进行有效评估。