基于数据挖掘和网络药理学探讨川贝母治疗肺系疾病的核心中药和机制

李丁艾,孙兆泉,尚军,3*

(1.青海师范大学生命科学学院,西宁 810008; 2.青海师范大学,青藏高原药用动植物资源重点实验室,西宁 810008; 3.青海师范大学,高原科学与可持续发展研究院,西宁 810008)

在宏观层面,数据挖掘是从庞大、复杂的随机不完全数据中提取隐形、有用、可信信息的有力手段[1-3]。中国古代医药典籍蕴含着大量古人用药隐形而又非常有效实用的用药规律,揭示古籍中药处方配伍规律,明确用药辩证关系,有利于指导现代中药临床用药和中药新药配方研究[4-6]。在微观层面,利用网络药理学探究药物疾病之中的靶点信息蛋白、预测所具功能和作用通路,可以对药物治疗疾病的作用机制更加深入认知,这也与中药多通路多靶点发挥作用理念相符合[7-8]。例如,Ma等[9]利用数据挖掘确定了3个治疗直肠癌气血两虚症核心处方,进一步利用网络药理学和分子接技术对核心处方的潜在机制进行探究,发现治疗过程中涉及的最重要途径是有丝分裂原-活化蛋白激酶(MAPK)级联反应、白细胞介素-17、肿瘤坏死因子(TNF)和血管内皮生长因子(VEGF)途径。李泽宇等[10]通过数据挖掘技术发现茯苓、黄柏、牛膝等八种中药常用于治疗痛风,且这八种中药在治疗痛风过程中涉及癌症通路、糖尿病并发症中的高级糖基化终末产物-受体(advanced glycation end products-receptor for AGE,AGE-RAGE)信号通路等,这些技术的结合使用有利于阐述中药和疾病的关系,从而加深对中药机制的理解。

中药川贝母(FritillariaecirrhosaeBulbus)为百合科植物川贝母(FritillariacirrhosaD.Don)、暗紫贝母(FritillariaunibracteataHsiao et K.C.Hsia)、甘肃贝母(FritillariaprzewalskiiMaxim.)或梭砂贝母(FritillariadelavayiFranch.) 的干燥鳞茎,味苦、甘,性微寒;归肺、心经;主治清热润肺,化痰止咳;用于肺热燥咳,干咳少痰,阴虚劳嗽,咯痰带血[11]。现代药理学实验证明贝母生物碱具有镇咳抗炎、降压、增强心肌收缩力、抗肿瘤、抗菌作用[12-13]。采用数据挖掘的方法对贝母治疗肺系病方剂进行分析,研究其配伍应用规律,进一步利用网络药理学分析,分析核心药对治疗支气管哮喘的作用机理,为贝母治疗肺系疾病方剂中的应用规律研究提供依据,为其临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 方剂筛选

以方剂组成含“贝母”,主治或功效含“咳嗽”“肺热”“肺咳”“咳”“喘”“哮”“肺胀”“肺络张”“肺痿”“肺痈”“肺痨”“肺癌”“肺水”“肺厥”“肺衰”“尘肺”“悬饮”“干肋痛”等为检索条件[14],运用《中医资源网》中医药数据库方剂数据库检索模块收集含贝母的处方。去重,筛选出含贝母处方420个,涉及中药463味。

1.2 中药名称规范与录入

参考2020版《中国药典》(一部)及《中华本草》对处方涉及中药名称进行规范,药材相同但产地不同的药物名称统一,如“贝母”统一为“川贝母”;“土贝母”“象贝母”统一为“浙贝母”;“牛黄”“西牛黄”统一为“牛黄”。炮制后药材性味归经及主治功效有较大变化的保留炮制名称,如“生地黄” 甘,寒,归心、肝、肾经,清热凉血,养阴,生津;“熟地黄” 甘,微温,归肝、肾经,滋阴补血,益精填髓。

1.3 用药频次与关联规则

1.3.1 数据筛选

建立“处方-组分”Excel 2010数据库,运用数据透视表构建药物频次矩阵,筛选使用频次≥30的药物为高频药物。

1.3.2 高频药物药性分析

以2020版《中国药典》和《中华本草》记载药物性味归经,构建高频药物性、味、归经Excel数据库。录入原则,如单味药具有多个药味,则全部统计录入,如“川贝母”味甘、苦,则“甘”和“苦”均作统计;单味药具有多个归经,全部统计录入,如“川贝母”归肺、心经,则“肺经”和“心经”均作统计;药物四气归类将“微寒”归属为“凉”,“微热” 归属为“温”。并构建频次矩阵。

1.3.3 高频药物功效分类分析

以2020版《中国药典》《中华本草》及《中药学》记载中药主治功效,构建高频药物功效Excel数据库,检索录入药物二级功效,如“羌活”为“解表药”类项下“辛温解表药”。

1.3.4 高频药物关联规则

对使用频次≥30的高频次药物,经SPSS Modeler 14.1进行关联规则分析,构建药物之间关联网络,并利用Apriori 建模进一步挖掘出药物之间的配伍关系,设置最低条件支持度为10%,最小规则置信度为80%,最大前项数为5,增益及提升度不小于1为关联条件筛选核心药物组合。

提升度=置信度(前项/后项)/后项总概率

1.4 网络药理学

支气管哮喘(bronchial asthma,BA)为一个典型肺系病,以核心药对治疗BA作为例子进行研究。

1.4.1 核心药对活性成分筛选及靶点预测

利用中药系统药理学数据库及分析平台TCMSP[15](https://tcmspw.com/)检索核心药对的所有化学成分,基于药代动力学(absorption,distribution,metabolism,excretion,ADME)参数选取有效活性成分 (筛选条件为口服生物利用度≥30%,类药性≥0.18)及相应靶点,采用 UniProt(https://sparql.uniprot.org/)数据库矫正靶点的基因名。

1.4.2 支气管哮喘的靶点筛选

基于GeneCards数据库 (https:/www.genecards.org/) 数据库,将“bronchial asthma”作为检索词以预测目前已知的与BA相关的潜在靶点。

1.4.3 PPI网络的构建

利用Venny2.1.0 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)绘制药物及疾病靶点韦恩图,获取“药物-疾病”的交集靶点,将交集靶点导入 STRING 数据库[16](http://string-db.org/cgi/input.pl),选择“Multiple Proteins”,设定基因来源为“homo sapiens”,构建蛋白互作网络(protein-protein interaction network,PPI),下载以string_interations命名的.tsv文档,再将文档数据导入数据可视化处理软件Cytoscape 3.9.1,借助CytoNCA 插件计算出介数中心度(degree centrality),根据度值筛选关键靶点。

1.4.4 “核心药物-成分-靶点-疾病通路”网络构建

利用数据可视化处理软件 Cytoscape3.9.1构建“药物-成分-靶点-疾病通路”网络图。节点(node)代表药物成分、靶点、药物及疾病名称,边(edge)代表各中药与活性成分、活性成分与靶点、疾病与靶点的相互作用关系,并应用 Cytoscape3.9.1 软件中的 CytoNCA插件获取位居前 5 的关键成分,用于后续验证。

1.4.5 GO与KEGG通路富集分析

将关键靶点导入 DAVID 数据库(https://david.ncifcrf.gov/)中,阈值设为P<0.05,进行GO功能富集和 KEGG 通路富集分析,探究BA核心靶点在生物过程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和细胞组分(cellular component,CC)方面涉及的功能及通路并借助微生信网站(http://www.bioinformatics.com.cn/)对结果进行可视化绘图。

1.5 分子对接验证

从PDB(https://www.rcsb.org/)数据库下载靶点的 PDB 文件,利用 PYMOL 对受体蛋白进行去水、去配体等操作,从 PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库下载活性成分 SDF 文件,运用openbabel 软件转换为 Mol2 格式文件,利用 AutoDock-Tools-1.5.6 对受体蛋白及配体进行加氢、平衡电荷等操作,保存为pdbqt 格式文件,并运用AutoDock-Tools-1.5.6 对处理好的活性化合物与靶蛋白进行对接及能量计算,利用Autodock Vina 1.1.2 软件对处理后的化合物与靶标进行对接,PyMOL 软件用于可视化关键化合物和蛋白质靶标对接结果。

2 结果与分析

2.1 数据挖掘结果

2.1.1 用药频次分析

将筛选出的贝母处方中的全部药物进行频次分析,结果显示总计463味中药,累计频次为5 033次,其中频次≥30的药物有35味,累计频次2 944次,见表1。其中含“川贝母”药方411个占97.9%,说明川贝母较浙贝母在治疗肺系疾病方面更具有显著疗效,对其用药规律的深度挖掘,更具有开发前景和意义。

表1 含贝母肺系病处方中高频次单味中药(频次≥30)

2.1.2 含贝母肺系疾病中药组方核心药物组合分析

基于关联规则分析,构建高频药物网络关联图及Apriori模型,设置支持度为10%,最小置信度80%,最大前项数5为条件挖掘出含川贝母治疗肺系相关疾病中药方剂中潜在的药物组合,共得到核心药物组合70组,其关联规则网络可视化展示如图1所示。其中增益及提升度均大于1,具有药物组合统计学意义的药物组合43对,如表2～表4所示。

图1 含川贝母治疗肺系疾病高频药物(频次≥30)关联网络化展示

表2 含贝母肺系疾病中药处方高频核心二联药物组合

表3 含贝母肺系疾病中药处方高频核心三联药物组合

表4 含贝母肺系疾病中药处方高频核心四联药物组合

2.1.3 含贝母肺系疾病中药组方核心药物组合聚类分析

经SPSS Statistics 25统计软件对高频药物(频次≥30)进行系统聚类分析,数据录入格式采用如下方法,即用“1”和“0”表示某味药在某一药方中的存在与否,编制Excel表格。结果当截距为19.0时,共得到8类,如图2所示,具体分类见表5。

图2 含贝母肺系疾病核心药对聚类分析树状图

表5 含川贝母治疗肺系疾病高频药物系统聚类分析

表6 活性成分与对应靶点分子对接结果

2.2 网络药理学结果

2.2.1 核心药物及BA相关靶点的筛选

将经2.1.2节分析可得的核心药对“川贝母-人参”导入到TCMSP数据库进行活性成分和成分靶点筛选,去重,获得34个活性成分,101个成分靶点。将“bronchial asthma”作为检索词在GeneCards数据库获得2 487个疾病靶点。

2.2.2 Hub靶点筛选及PPI网络构建

将药物的成分靶点和疾病靶点导入到Venny2.1.0在线平台,获得药物与疾病交集靶点共70个,并制作韦恩图如图3所示。再将交集靶点导入到String 平台,下载蛋白质互作分析(protein protein interaction,PPI)的TSV数据文件,导入到 Cytoscape3.9.1 软件中获得蛋白互作网络图,如图4所示。可知共有70个节点,527条边。借助CytoNCA 插件计算出度值,根据度值筛选Hub靶点。通过构建PPI网络,可知排名前5的Hub靶点包括“AKT1”“PTGS2”“IL1B”“JUN”“PPARG”。其中PTGS2和JUN为两味药材所共有的靶点。AKT1基因编码的是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,可通过磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)依赖的机制被胞外信号激活,为PI3K信号通路中下游最重要因子,对于肺部疾病具有调节纤维化的作用。Lu等[17]证明了 PI3K/Akt 通过上调细胞生长和胶原蛋白表达在博莱霉素诱导的人肺成纤维细胞的纤维化中起重要作用。经研究PI3K/Akt/mTOR 通路被认为与气道炎症密切相关,并受各种上游蛋白的调节[18],当哮喘小鼠中支气管上皮细胞特异性Brg1敲除后,哮喘严重程度得到改善,PI3K/Akt/mTOR通路被激活。通过比较哮喘模型组大鼠、治疗组大鼠和阳性组大鼠中PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达[19],发现模型组PI3K、Akt蛋白表达显著增加,而治疗组和阳性组中PI3K、Akt蛋白表达明显下降,故PI3K/Akt通路可以看作治疗支气管哮喘的重要通路,AKT1也为其重要靶点之一。PTGS2是编码前列腺素内过氧化物合酶(PTGS)同工酶之一,也叫做环氧合酶2(COX-2)[20],表达部位包括大部分组织间的滑膜细胞,正在排卵的滤泡,在绝大多数被生长因子、细胞因子、佛波酯或激素刺激的组织,抑制糖皮质激素,作为“炎症反应基因”,有炎症时会产生前列腺素,调控有丝分裂,参与细胞生长,在调节排卵时起信号作用。经研究可知过敏性哮喘可使气管壁内平滑肌肥大,致敏肥大细胞β-己糖氨酸酶的释放和环氧合酶2(COX-2)介导的前列腺素D-2(PGD-2)和前列腺素F-2α(PgF-2α)的产生[21]。IL1B(白介素1β)为促炎性因子,也是公认的中性粒细胞增多的诱因,可能导致明显的中性粒细胞肺部炎症。Kim等[22]发现哮喘患者中性粒细胞增多、激素抵抗和疾病严重程度与NLRP3和IL-1β表达增加相关。病毒诱导的哮喘加重会引起Th1型中性粒细胞增多和Th2型炎症,这也与白介素1β的分泌有关[23]。JUN编码转录因子激活蛋白1(activator protein 1,AP-1),其家族成员包括c-Jun、JunB、JunD、Fra-1、Fra-2和c-Fos,是TGF-β信号通路的下游分子[24]。Patil等[25]发现AP-1可能是激素在哮喘等慢性炎症性肺部疾病中作用的重要分子机制,并对肺部炎症性疾病的治疗有一定的帮助。已知嗜酸性粒细胞在哮喘中起着核心作用,Kankaanranta等[26]发现TNF-α可抑制嗜酸性粒细胞的凋亡,AP-1可增强肿瘤坏死因子-α的抗凋亡作用。PPARG编码过氧化物酶体增殖物激活受体 γ(PPAR-γ),是一种参与多种细胞过程的配体激活转录因子,参与多种细胞过程,和氧化应激基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)与哮喘风险相关[27]。呼吸道上皮细胞(airway epithelial cells,AECs)对进入呼吸系统的空气中的刺激物进行炎症反应,Lakshmi等[28]发现,PPARG直接与在黏蛋白5AC中发现的PPAR反应元件结合并抑制基因表达。同样,PPARG调节原代人支气管上皮细胞中的黏蛋白和炎症因子,因此AEC-PPARg有作为治疗哮喘药物靶点的潜力。由上可知,这些关键靶点可作为“川贝母-人参”治疗支气管哮喘的重要指标。

图3 药物活性成分靶点与疾病靶点韦恩图

圆代表靶点,颜色越深,圆越大表示与其他靶点互作关系越强

2.2.3 “核心药物-成分-靶点-疾病”网络构建结果

将核心中药各活性成分及获取的核心靶点,导入 WPS Excel 表格中建立相互对应关系,运用 Cytoscape 3.9.1 软件构建“核心药物-成分-靶点-疾病”网络图,如图5所示。图5中共有226 个节点及807 条边,其中包括28个药物活性成分,167个靶点和30条P排名前列的信号通路。并用CytoNCA 插件计算出DC值,对该网络进行拓扑分析。通过构建“核心药物-成分-靶点-疾病”网络,根据度值排列,结果显示排名前5的成分为“beta-sitosterol”“kaempferol”“Stigmasterol”“suchilactone”“Fumarine”。

2.2.4 GO、KEGG富集分析

将70个核心靶点导入到DAVID数据库进行GO和KEGG富集分析,选择选择“Homo sapiens”,以P<0.05 为筛选条件,得到GO条目共385条,将P由小到大进行排列,分别对BP、CC、MF的前10进行可视化分析,如图6所示。由GO功能分析可知,其中BP有277条,主要参与对脂多糖、药物、有机环状化合物、异种刺激的反应,并与一氧化氮生物合成正调节、凋亡过程正调节等生物学过程;CC有42条,主要细胞溶胶、突触前膜、大分子组分复合膜、膜筏、核质等细胞组分;MF有66条,主要与酶结合蛋白、同源二聚化活性、RNA聚合酶II-转录因子活性、配体激活的序列特异性DNA结合等分子功能。KEGG通路富集分析可知条目共89条,对排名前10 的通路进行可视化分析,如图7所示。发现主要参与的通路包括脂质和动脉粥样硬化、流体剪切应力和动脉粥样硬化、弓形虫病、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、癌症通路、肿瘤坏死因子信号通路、乙型肝炎、化学致癌-受体激活、IL-17信号通路等,说明筛选出的70个靶点蛋白可能通过这些通路发挥药理活性,改善疾病病理变化。这也符合中药通过多途径、多靶点发挥治疗作用的机制[29]。

选用每个模块P值最小的前10个条目,其值越大,颜色越偏向红色,反之则偏向蓝色;条带的长短表示富集数

此气泡图中其值越大,颜色越偏向红色,反之则偏向绿色;点的大小表示富集数

2.3 活性成分与关键靶点的分子对接

利用Autodock Vina 1.1.2对2.2.2节获取的Hub前五靶点和与2.2.3节获取的排名前5的活性成分进行对接,结果见表 6。利用 PyMOL 软件对靶点蛋白与成分对接的最佳构象进行可视化分析,直观展示其构象关系,结果见图8。分子对接结合能小于-5.0 kcal/mol则表明结合活性较强,且结合能越小,可知高频活性药物中Fumarine与BA疾病靶点的PTGS2最为紧密。

3 结论

肺系疾病是一种常见和多发疾病,包括肺脏主气、司呼吸、宣肺肃降等功能异常引发的肺脏疾病,如咳嗽、喘证、哮病、肺痈、肺痿及相关疾病、如感受外邪类引发的感冒、风温、秋燥、肺风、劳风等和鼻咽类疾病鼻鼽、鼻渊、喉喑、喉痹等[30]。川贝母在止咳祛痰、平喘、抗菌和抗肿瘤等方面具有较好的疗效,其镇静、缺氧状态下增强人体耐力的作用,对于痰多咳嗽的哮喘病人有益,其消炎抗菌作用能够有效的改善呼吸道感染[31]。

通过数据挖掘技术分析可知,川贝母常与苦、甘、辛和微寒的中药材配伍,在符合肺脾同治[32]的中医理念基础上,用于治疗不同病症的肺系疾病,如《退思集类方歌注》一书中记载的紫菀汤,其药物组成为甘草、桔梗、紫菀、川贝母、杏仁;紫菀降气、贝母润肺、杏仁消痰、合甘、桔散风泄热。经关联规则和聚类分析得到含川贝母的核心药对、药组组合,为临床肺系疾病的诊疗与新药研究提供了理论支撑,开拓新处方思路,同时为后续剂量关系的研究奠定基础。

利用网络药理学预测核心药对治疗支气管哮喘的核心靶点和信号通路可知,“AKT1”“PTGS2”“IL1B”“JUN”“PPARG”均可作为治疗支气管哮喘的关键靶点,尤其Fumarine 对PTGS2结合紧密,为未来研究支气管哮喘发作所涉及的信号通路及因子变化提供理论基础,也为进一步开展临床及基础研究,即与分子生物学、代谢组学等学科的融合起到指导作用。