不同成熟度烤烟萜类物质含量及相关基因研究

刘 芳，宋笑龙，马浩波，孟智勇，宗胜杰，王 宏，张 昭，田洪彰

（1. 河南省农业科学院烟草研究所，河南 许昌 461000；2. 河南省烟草公司洛阳市公司，河南 洛阳 471000；3. 山东临沂烟草有限公司费县分公司，山东 临沂 276000）

香气是评价烟叶内在质量的核心内容和重要指标。烟叶烤后散发出来的细腻清新的香气大多来源于致香前体物质的降解，萜类是其中重要一类。烟草中萜类致香前体物主要有类胡萝卜素（四萜类化合物）、类西柏烷类和赖百当类（二萜类化合物）[1-3]。赖百当类化合物一般只存在于香料烟和部分雪茄烟中，西柏烷类[4-6]则是由烤烟表皮腺毛合成并分泌产生，调制后主要降解为茄酮及其衍生物[7]。类胡萝卜素属于四萜化合物，其降解产物是烤烟中性致香物质的重要组成成分，并且香味物质阈值相对较低、刺激性较小、香气质较好，能够使烟叶产生木香、花香、果香和甜香等诸多特色香气[8-9]。前人大量研究了萜类化合物合成和降解途径[10-12]，也有部分学者对萜类化合物合成关键酶基因[13-14]进行分析，但关于不同成熟阶段的烤烟萜类化合物相关基因表达与烟叶品质综合分析的报道较少。成熟度是影响烟叶品质的重要因素，采收成熟度偏低或偏高会导致烤后烟叶表现出青杂气、刺激性重，香气不足，口味寡淡等弊端，严重影响烟叶原料的工业可用性[15-19]。只有深入研究致香物质在不同成熟度的差异规律，才能精准把握烟草采收最佳成熟度[20-22]。

中烟100 是河南烟区的主栽品种，本项目针对中烟100 不同成熟度腺毛特性和叶面分泌物合成关系进行差异性分析，并分析了萜类化合物合成和降解通路中相关酶基因表达的差异性，结合不同成熟度烤后烟叶香气物质含量开展比对分析，以期探明烟叶的最适采收期，为进一步提高烤烟香气质量和工业可用性奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2022 年在河南省农业科学院烟草研究所试验田开展，试验品种为中烟100。试验地块肥力中等、均匀一致，行株距为1.2 m×0.5 m，其他田间栽培管理及病虫害防治按照当地优质烟生产技术规程实施。试验烤房为密集烤房，符合DB43T 1635—2019 《密集烤房建设及配套设备技术规范》标准。烤房装烟室规格为：8.0 m×2.7 m×3.5 m。

1.2 试验设计

以16～18 叶位和10～13 叶位分别代表上部叶和中部叶作为研究目标，以常规成熟采收为对照，根据实际生产，设置采收成熟度差异梯度试验，成熟度设置及外观标准如表1。

表1 不同成熟度标准Table 1 Criteria for different maturity levels

分别在各部位叶片不同成熟度阶段，取5 株代表性烟株的鲜烟叶，沿主脉两侧截取8片直径为5 cm的圆形叶片混合用于叶表面分泌物的提取与检测，同时取10 cm 左右的长条状叶片混合用于腺毛密度观察、类胡萝卜素测定和RNA 的提取，每个处理重复3 次。其他叶片按照设定成熟度采收后，分别以三段式工艺在相同的烘烤条件下进行调制，烤后各处理样品分别取2 kg 用于常规化学成分测定、香气成分测定及感官质量评价。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 烟叶腺毛形态观察及腺毛密度统计 用FAA 固定液固定烟叶，每个样本做3 次重复，经0.2%罗丹明染料染色30 min 后，用清水去除未结合的罗丹明B，通风条件下自然晾干，沿着叶片中部主脉两侧1 cm 处剪取1 cm×1 cm 左右的叶片组织，使用超景深显微镜观察并拍照，观察腺毛形态并对腺毛密度进行统计。

1.3.2 类胡萝卜素含量测定 采用95%乙醇浸提，分光光度计法检测[23]。

1.3.3 西柏烷二萜醇的测定 取样后采用气相色谱-质谱联用仪（Agilent 7890-5977）按照行业标准YC/T 470—2013 进行西柏烷二萜醇含量的测定与分析，每个处理重复3 次。

1.3.4 烟叶总RNA 的提取 采用RNA 提取试剂盒（TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit）提取参试烟叶的总RNA，将提取的RNA 用适量的DEPC 水（经焦碳酸二乙酯处理过并经高温高压灭菌的超纯水）溶解后，置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.3.5 萜类化合物合成关键酶基因表达量测定采用One Step RT-PCR 反应试剂盒（TaKaRa One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit）在同一反应管内连续进行RNA 的反转录和PCR 扩增反应，每个处理重复3 次。根据GenBank 发布的DXR、CYP71D16、PAL、C4H、CHS、4CL和L25（内参基因）序列设计基因扩增引物（见表2）。qRT-PCR反应体系为20 µL：2×PCR Buffer 10 µL，TaqHS 0.4 µL，Mix 0.4 µL，正反向引物各0.4 µL，50×ROX 0.4 µL，Total RNA 2 µL，ddH2O 6 µL。扩增反应条件：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s（前两步为反转录反应）；95 ℃变性5 s，60 ℃延伸34 s，40 个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，根据Ct值计算相对表达量。

表2 荧光定量PCR 引物序列Table 2 Sequences of fluorescence quantitative PCR primers

1.3.6 萜类化合物降解的中性致香物质含量测定以二氯甲烷为萃取溶剂，采用Agilent 7890-5977 气相-色谱质谱联用仪离子扫描内标（北京微标标物公司）相对定量法对烘烤调制后烟叶的中性致香物质进行定性定量分析[18]，每个处理重复3 次。

1.3.7 常规化学成分测定 不同成熟度烟叶采集后通过同一工艺进行烘烤处理，利用连续流动分析仪，参照行业标准YC/T 159—2002 测定总糖、还原糖，YC/T 160—2002 测定烟碱，YC/T 161—2002测定总氮，YC/T 162—2002 测定氯含量，YC/T 173—2003 测定钾含量。

1.3.8 感官质量评价 各处理烘烤后的烟叶经过恒温恒湿回潮，切丝，卷制成（900±15）mg/支、长度为85 mm/支的单料烟支。由评吸专家参照行业标准YC/T 138—1998 对香气质、香气量、杂气、浓度、劲头、刺激性、余味、燃烧性和灰色9 个单项指标进行打分，取其平均值，采用专家咨询法并借鉴相关研究方法[24]，对9 个指标分别赋以25%、15%、12%、10%、10%、13%、10%、2.5%和2.5%的权重，采用加权平均法计算各处理的感官质量综合分值。

1.4 数据分析

采用Excel 2010、SPSS 19.0 进行处理与分析。

2 结 果

2.1 不同成熟度烟叶腺毛形态密度分析

腺毛按其形态可分为长柄腺毛、短柄腺毛和保护毛，一般认为，腺毛密度大、腺毛分泌物多的烤烟吃味醇和、香气浓郁[7]。腺毛形态如图1 所示，腺毛密度统计详见表3。

图1 不同处理烟叶腺毛形态Fig. 1 Glandular hair morphology in flue-cured tobacco under different treatments

表3 不同处理烤烟腺毛密度Table 3 Glandular hair density in flue-cured tobacco with different treatments

从图1 和表3 可以看出，各成熟度烟叶均以长柄腺毛居多（占60%左右），短柄腺毛较少（占25%左右），保护毛最少（占15%左右）。中部叶和上部叶的腺毛变化规律一致，随着成熟度的提高，腺毛密度呈显著下降趋势，烟叶长柄腺毛和短柄腺毛脱落严重，保护毛变化幅度较小。随成熟度提高，相邻成熟度烟叶腺毛总量脱落幅度增大，以T3 与T4处理之间的脱落幅度最大，中、上部叶分别为33.57%、29.50%，T1 与T2 处理之间最小，分别为11.13%、12.33%。

2.2 不同成熟度烟叶类胡萝卜素含量

类胡萝卜素是一类重要的四萜类化合物，一般认为类胡萝卜素含量越高，烤后烟叶刺激性较小、香气质较好，能够产生木香、花香、果香和甜香等特色香气[8]。由表4 可知，随着烟叶成熟度的提高，中、上部烟叶中的类胡萝卜素含量均不断降低，且各处理间差异达到显著水平。降解幅度随成熟度提高则表现为慢-快-慢的趋势，T2 至T3 处理（成熟至完熟阶段）降幅最大，中、上部叶分别达到了40.18%、33.83%，T1 至T2（欠熟至成熟）、T3 至T4（完熟至过熟）处理降解幅度相对较小。同一成熟度下烟叶类胡萝卜素含量表现为中部叶>上部叶。

表4 不同处理烤烟类胡萝卜素含量Table 4 Carotenoid content in flue-cured tobacco under different treatments

2.3 不同成熟度鲜烟叶西柏烷二萜醇含量

西柏三烯二醇是烟草表面腺毛最主要的分泌物，一般认为，西柏三烯二醇含量越高，烟叶香气越醇[11]。从图2 可知，中部叶α-西柏三烯二醇（α-CBD）随着成熟度的提高呈现先升高后降低的趋势，T3 处理含量达到最高，分别较T1、T2、T4高出13.77%、6.91%、2.42%；β-西柏三烯二醇（β-CBD）随着成熟度的提高呈现不断降低的趋势；(α+β)-西柏三烯二醇含量在T3 处理时最高，显著高于其他3 个处理。上部叶α-CBD、β-CBD、(α+β)-CBD含量变化趋势与中部叶一致，α-CBD 含量T3 处理最高，T3 和T4 处理均显著高于T1、T2，β-CBD含量 T1 处理最高，且不同处理间差异显著；(α+β)-CBD 含量T3 处理最高，达到289.89 µg/g。

图2 不同处理烤烟西柏三烯二醇含量Fig. 2 Content of cetylene glycol in flue-cured tobacco under different treatments

2.4 不同成熟度烟叶萜类化合物代谢基因表达量

基因CYP71D16和DXR共同参与了西柏烷类化合物的合成，基因PAL、C4H、4CL及CHS是类胡萝卜素降解与转化的关键基因。由图3 可知，随着成熟度的增加，烤烟上部叶CYP71D16和DXR基因表达量呈现先升后降的趋势，均在T3 处理达到最高；类胡萝卜素降解的关键基因PAL及4CL的表达量随着成熟度的增加逐渐升高，C4H、CHS基因的表达量均表现为先升后降的趋势，在T3 处理达到最高且显著高于其他3 个处理。烤烟中部叶CYP71D16和DXR基因表达量呈现先升后降的趋势，其中CYP71D16的表达量以T2 处理最高，且各处理间存在显著差异，而DXR的表达量以T3 处理最高；类胡萝卜素降解的关键基因PAL的表达量呈上升趋势，C4H、4CL及CHS的基因表达量逐渐上升，在T3 处理达到最高后开始呈现降低趋势。

图3 不同处理萜类化合物合成与降解关键基因表达量Fig. 3 Expression levels of key genes for synthesis and degradation of terpene compounds under different treatments

2.5 不同成熟度烟叶萜类化合物降解的中性致香物质含量

从表5 可知，随着成熟度的提高，类胡萝卜素降解类中性致香成分总量呈现逐渐降低的趋势，与2.2 中类胡萝卜素的研究结果一致。

表5 不同处理烤后烟叶萜类化合物降解的中性致香物质含量Table 5 Contents of neutral aroma components degraded by terpenes in flue-cured tobacco leaves with different treatments μg/g

西柏烷类降解的中性致香成分总量呈现先升高后降低的趋势，中、上部叶均以T3 处理达到最高。中部叶T3 处理分别较T1、T2、T4 高出9.54%、4.44%、6.15%，上部叶T3 处理分别较T1、T2、T4高出37.50%、21.22%、12.73%。同一成熟度，中部叶>上部叶，与2.3 中西柏烷二萜醇的研究结果相一致。

2.6 不同成熟度烤后烟叶常规化学成分差异

从表6 可知，随着成熟度的增加，上部叶总糖、还原糖呈先升高后降低的趋势，以T3 处理最高，且显著高于其他3 个处理。总氮含量逐渐降低，各处理的钾离子、氯离子和烟碱含量差异不显著，其中烟碱含量（3.55%～3.96%）偏高。中部叶总糖、还原糖呈先升高后降低的趋势，以T2 处理最高，各处理的总氮、烟碱、氯离子含量差异不显著，钾离子含量T3 处理显著高于T1、T2、T4，分别高出16.84%、17.89%、15.79%。从化学成分协调性[25]来看，上部叶T3 处理的糖碱比、钾氯比均最高，各处理的氮碱比差异不大；中部叶糖碱比、氮碱比、钾氯比均以T3 处理最高。结果表明，在一定范围内，成熟度的增加有利于总糖和还原糖含量及糖碱比和钾氯比的提升，使烤后烟叶化学成分更协调。

表6 不同处理烤后烟叶常规化学成分Table 6 Conventional chemical components of flue-cured tobacco leaves with different treatments

2.7 不同成熟度烤后烟叶感官质量

由表7 可知，中、上部烟叶不同成熟度的感官质量评价结果均以T3 处理表现最佳。上部叶T3 处理的香气质好、劲头足、刺激性小、余味绵长，吸食口感表现为细腻柔和，有回甜香，T1 处理燃烧性稍差，香气透发性不佳，香气量略显不足，而T4处理烟气口感较差，刺激性明显，浓度稍低。中部叶T3 处理表现为香气质好、香气量大，烟气状态较好，抽吸时满足感强，相比于T3 处理，T2 处理香气量、烟气浓度较好，稍有杂气，余味稍残留，T4 处理香气量略欠缺，浓度偏低，劲头、燃烧性较差，而T1 处理烟气质量略粗糙，香气质欠佳，杂气重，余味平淡，综合表现最差。中部叶感官质量综合得分表现为：T3>T2>T4>T1。

3 讨 论

本研究通过测定6 个与对萜类化合物合成与降解相关基因表达量，结合成熟过程中烟叶表面腺毛变化情况及烤后烟叶品质，证实烟叶成熟度是影响烤烟香气成分的重要因素，与烤后烟叶香气含量及感官评吸质量密切相关。随着叶片逐渐成熟，长柄腺毛的腺头逐渐脱落，腺毛密度降低，与前人研究一致[7]。在完熟叶片中基因CYP71D16和DXR的表达量最高，对应烤后完熟烟叶中性致香成分总量最多、感官评价得分最高，表明烟草中二萜类物质的降解物无论是在提升烟香、改善烟气余味还是在降低烟气刺激性、增进吸味等方面都发挥了重要的作用，与彭国岗等[11]、张思琦等[13]研究结果一致。随着成熟度的增加，基因PAL的表达量上调，C4H、CHS基因在完熟叶片中表达量最高，表明类胡萝卜素转化、降解过程关键基因表达量与烟叶品质密切相关，与文利超[14]等研究结果中类胡萝卜素降解基因PAL表达下调趋势相反。该文献中烟叶样品主要集中在大田旺长期，烟叶中的类胡萝卜素处于积累阶段，而本文烟叶采集于成熟衰老后期，类胡萝卜素以降解为主，这可能是类胡萝卜素降解酶基因表达量存在差异的重要原因。

本研究表明，在一定程度上，成熟度越高的烟叶物质转化越充分，化学成分越协调，香气越饱满，但过熟烟叶会导致内含物质降解过度，烟气平淡无味，满足感降低，整体质量下降，与前人研究结果一致。由于烘烤工艺也是影响烟叶色素降解幅度及香味物质含量的重要因素，不同成熟度烟叶自身生理生化变化不同，导致失水、变黄过程对烘烤条件的需求可能存在差异，但本文通过对烤前烟叶的萜类物质及相关基因表达量进行差异分析，避免了烘烤工艺对烟叶质量的影响，为选择适宜成熟度提供了更有效的数据支撑。本文涉及的西柏烷类只是腺毛分泌物中的一类，其他腺毛分泌物含量及对烟叶质量的影响有待于进一步研究。

4 结 论

本研究观测了不同成熟度中烟100 腺毛形态、结构以及主要萜类化合物含量的差异，利用qRT-PCR 技术初步探索了烤烟萜类化合物合成与降解相关酶基因表达量，结合烟叶内在品质综合分析表明，在当前烟叶生产中烟100 成熟采收基础上推迟采收5～7 d，使烟叶达到完熟程度，可提高烟叶的香气物质生成量，减轻烤后烟叶烟气杂气、刺激性，提高中上部烟叶质量及工业可用性。