雄激素受体与肿瘤浸润淋巴细胞对三阴性乳腺癌预后影响的相关性分析

张炯炯，郑彬，沈海幸，陈湛

雄激素受体与肿瘤浸润淋巴细胞对三阴性乳腺癌预后影响的相关性分析

张炯炯1，郑彬1，沈海幸1，陈湛2

1.慈溪市人民医院甲乳外科，浙江慈溪 315300；2.慈溪市人民医院病理科，浙江慈溪 315300

探讨雄激素受体（androgen receptor，AR）与肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）在三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）的表达特征和相关性及对预后的影响。收集2011年6月至2021年12月慈溪市人民医院收治的70例TNBC患者资料，免疫组化法检测AR表达，苏木精–伊红染色评估间质TILs表达水平，随访术后生存情况，分析AR表达和TILs表达水平与临床病理特征的关系，TILs与AR相关性及预后的关系。TNBC中AR表达与增殖指数Ki-67、是否有脉管癌栓密切相关（<0.05），TILs浸润水平与增殖指数Ki-67、是否复发转移密切相关（<0.05），Spearman秩相关检验提示AR表达与TILs浸润水平呈负相关（=-0.344，=0.004）。单因素Cox回归分析，TNBC脉管癌栓、淋巴结转移、AR表达、TILs浸润水平对无病生存期（disease-free survival，DFS）有影响（<0.05），多因素Cox回归分析示淋巴结转移对DFS有影响（<0.05）。AR在低Ki-67、有脉管癌栓的TNBC中表达率高，TILs在高Ki-67、无复发转移的TNBC中浸润水平高，TNBC中AR表达与TILs浸润水平呈负相关，淋巴结转移是影响TNBC预后的独立因素，AR和TILs及脉管癌栓是可能的预后因素，需要更多研究证实，提示TNBC可根据AR表达和TILs浸润水平进行精准治疗。

三阴性乳腺癌；雄激素受体；肿瘤浸润淋巴细胞；预后

乳腺癌是我国女性发病率首位、死亡率居前的恶性肿瘤，随着社会经济发展，预计我国的乳腺癌疾病负担将持续加重[1]。三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）和人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）均为阴性的乳腺癌，占乳腺癌的15%～20%。TNBC因其异质性大，侵袭性强，缺乏治疗靶点，治疗手段单一，易复发转移，是乳腺癌中预后较差的一个亚型[2-3]。面对诊治困境，临床需要新的生物标志物细分TNBC，寻找治疗靶点提高疗效。

现有研究提示雄激素受体（androgen receptor，AR）表达与TNBC的发生发展及预后相关，但相关结论并不一致[4-5]。而肿瘤浸润淋巴细胞（tumor- infiltrating lymphocytes，TILs）在TNBC中的高浸润水平提示相对好的预后[6-7]。本研究分析TNBC中的AR表达和TILs浸润水平及其相关性和预后影响。

1 资料与方法

1.1 病例资料

收集2011年6月至2021年12月慈溪市人民医院初诊并手术的70例TNBC患者的临床资料，术后免疫组化ER阴性（<1%细胞核染色），PR阴性（<1%细胞核染色），HER-2阴性（免疫组化结果0或1+或2+且荧光原位杂交检测阴性）[8-9]。患者年龄31～84岁，平均（53.3±11.6）岁。所有纳入研究者均行根治性手术（改良根治术或保乳根治术），按照术后评估进行辅助放化疗。

病例纳入标准：在慈溪市人民医院初诊行根治性手术的TNBC患者；术后按当时的诊疗规范予以辅助放化疗，未进行新辅助治疗；具备完整的临床病历资料，保存完整的术后病理标本；常规进行术后复查随访。排除标准：合并其他恶性肿瘤，手术时合并转移情况，术后未进行推荐辅助治疗，术后未定期复查或失联。本研究经慈溪市人民医院医学伦理委员会批准（伦理审批号：2019-LP-14）。

1.2 病理方法

免疫组化法测定AR表达，对70例石蜡包埋组织进行切片，使用AR抗体进行染色，AR阳性阈值定为1%（图1）[10]。按照国际乳腺癌TILs工作组共识，用苏木精–伊红染色评估间质TILs浸润程度，定义TILs浸润程度<10%为低浸润，≥10%且<40%为中浸润，≥40%为高浸润（图2）[11]。

图1 TNBC中AR表达情况（SP×100）

A.AR阳性；B.AR阴性

图2 TNBC中TILs浸润情况（HE×100）

A.低浸润；B.中浸润；C.高浸润

1.3 随访记录

记录患者的临床病理特征，包括年龄、肿瘤直径、组织学分级、Ki-67、脉管癌栓、腋窝淋巴结转移、AR表达及TILs浸润情况。随访周期：两年内每3个月随访1次，两年后每半年随访1次，以复发转移为终点，计作无病生存期（disease-free survival，DFS），随访截止时间为2022年12月，中位随访时间57个月。

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0统计学软件对数据进行分析，计数资料以例数（百分率）[（%）]表示，采用2检验进行简单关联性检验（多组率比较20%理论频数<5或存在理论频数<1时取Fish确切概率法；两组率比较存在1≤理论频数<5时作连续性修正，理论频数<1时取Fish确切概率法），分析AR和TILs在临床病理特征上的表达特点；采用Spearman秩相关分析AR表达与TILs浸润程度的相关性；用Kaplan-Meier绘制生存曲线，Log-rank检验比较DFS；应用单因素和多因素Cox回归分析影响DFS的因素，<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AR表达和TILs浸润水平与TNBC临床病理特征的关系

AR阴性48例（68.6%），AR阳性22例（31.4%）；TILs高浸润18例（25.7%），中浸润24例（34.3%），低浸润28例（40%）；复发转移13例（18.6%），无病生存57例（81.4%）。

TILs浸润水平与Ki-67值密切相关（2=7.548，=0.023），与是否复发转移密切相关（2=6.343，=0.038），见表1；AR表达与Ki-67值密切相关（2=9.291，=0.002），与有无脉管癌栓密切相关（2=4.822，=0.028），见表2。TILs更倾向在高Ki-67、无复发转移的TNBC中高浸润；AR更倾向在低Ki-67、有脉管癌栓的TNBC中表达。

表1 TNBC的TILs浸润水平与临床病理特征的关系[n（%）]

表2 TNBC的AR表达与临床病理特征的关系[n（%）]

2.2 TILs浸润水平与AR表达的相关性分析

由表1知，TILs浸润水平与AR表达密切相关（2=8.389，=0.015），采用Spearman秩相关检验，TILs浸润水平与AR表达呈负相关（=–0.344，=0.004），见表3。

表3 TILs浸润水平与AR表达的相关性分析[n（%）]

2.3 AR表达、TILs浸润水平与TNBC患者DFS生存分析

AR阴性患者较AR阳性患者有更好的DFS，差异有统计学意义（Log-rank=0.031），见图3。TILs浸润程度的DFS生存曲线在中段存在交叉，对后期可能存在正相关，但无统计学意义（Log-rank=0.060），见图4。

图3 AR与TNBC无病生存期的Kaplan-Meier分析

图4 TILs与TNBC无病生存期的Kaplan-Meier分析

2.4 影响TNBC患者DFS的单因素及多因素分析

对年龄、肿瘤直径、组织学分级、Ki-67、脉管癌栓、淋巴结转移、AR表达及TILs浸润程度，逐一构建单因素Cox比例风险模型，见表4。结果发现，脉管癌栓对DFS的影响具有统计学意义（=5.155，95%：1.718～15.470，=0.003）；淋巴结转移对DFS的影响具有统计学意义（=5.849，95%：1.904～17.965，=0.002）；AR表达对DFS的影响具有统计学意义（=3.147，95%：1.051～9.422，=0.040）；TILs浸润程度对DFS的影响具有统计学意义（=0.427，95%：0.188～0.970，=0.042）。

表4 影响TNBC无病生存期的单因素Cox回归分析

注：*为对照组

纳入脉管癌栓、淋巴结转移、AR表达及TILs浸润程度，构建多因素Cox比例风险模型。结果发现，淋巴结转移对DFS的影响具有统计学意义（=8.358，95%：2.168～32.214，=0.002）；其余变量对DFS的影响均无统计学意义，见表5。

3 讨论

本研究TNBC的AR阳性率31.4%，与既往研究的阳性率10%～43%相符[12]。AR在TNBC中的临床病理特征关系和预后的研究很多，AR与年龄、组织学分级、Ki-67、区域淋巴结、脉管癌栓等存在相关性，但结论各异。有研究显示AR表达与低Ki-67、较低的组织学分级等低侵袭性临床病理特征相关，也有研究显示在AR阳性的TNBC中淋巴结转移数量要多于AR阴性TNBC[13-14]。而AR作为TNBC预后指标的研究结论也不一致[15]。究其原因：一方面是TNBC的高度异质性及分型差异，研究质量参差不齐，AR阳性阈值并不统一；另一方面是AR的复杂作用机制及各种旁路信号交叉影响，AR可与ER、HER-2等通路、免疫微环境存在串扰机制，成为一个复杂多变的角色。

本研究显示AR更倾向在低Ki-67、有脉管癌栓的TNBC中表达，生存曲线提示AR阴性具有更好的预后。单因素回归提示AR阳性对DFS的不良影响有统计学意义，而多因素回归没有统计学意义，此结论与既往文献报道相符。

TILs是肿瘤免疫微环境的重要组成部分，是肿瘤免疫原性的重要标志物，分为巢内和间质内，研究间质TILs更有临床意义。间质TILs免疫成分复杂，包括CD8+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、自然杀伤细胞、CD4+调节性T细胞（Treg）、树突状抗原呈递细胞、巨噬细胞等，其类型和浸润水平和预后密切相关，可帮助TNBC疗效评估及预后判断，既往研究提示TNBC中TILs高水平浸润，治疗反应更好，预后更好[16-17]。

本研究提示TILs更倾向在高Ki-67和无复发转移的TNBC中高浸润，生存曲线TILs在中段存在交叉，后段可能存在正相关，无统计学意义。单因素回归分析提示TILs、AR、脉管癌栓、淋巴结转移对DFS的影响具有统计学意义，纳入多因素后，淋巴结转移对DFS的影响具有统计学意义，其余因素失去统计学意义。这种情况需考虑混杂因素及中介变量的影响，采用两因素分析探讨影响TILs的干扰因素，发现AR和脉管癌栓对TILs有影响。采用去因素法建模，剔除AR和脉管癌栓，则多因素分析提示TILs对DFS影响有统计学意义；剔除AR，多因素分析TILs对DFS影响有统计学意义；剔除脉管癌栓，多因素分析TILs对DFS影响也有统计学意义。而从理论和既往文献考虑，AR和脉管癌栓是需要列入模型的暴露因素或混杂因素，不建议剔除，本研究只能从单因素分析角度推测AR和TILs是可能的预后因素。本研究TILs的预后意义与既往研究的差异可能与样本量相对较小有关，故需要更大的样本量，减少不均衡的混杂因素，提高回归建模效率得出更可靠的结论。

TNBC中AR与TILs存在负相关线性关系，符合既往文献报道，在前列腺癌中这一关系也是成立的，AR可通过MHC-Ⅰ影响TILs浸润水平，提示可通过尝试抑制AR来改善肿瘤免疫微环境，调高肿瘤免疫，甚至加用免疫治疗达到改善预后的目的[18]。

TNBC是近年来的研究热点。2019年复旦大学提出TNBC复旦分型，将其分为腔面雄激素受体型（luminal androgen receptor，LAR）、免疫调节型（immunomodulatory，IM）、基底样免疫抑制型（basal-like immune-suppressed，BLIS）和间质型（mesenchymal-like，MES）4个亚型[19]。本研究的AR及TILs可对应其LAR及IM型，涉及抗AR治疗和免疫治疗。在Future精准临床试验中，IM型应用免疫治疗可明显改善TNBC患者的预后，LAR型的抗AR治疗却令人失望[20]。这说明TILs在TNBC中提示免疫微环境对精准治疗、疗效评估、预后提示意义重大，而AR在乳腺癌中的作用机制复杂交互，多种串扰机制并存，需要进一步深入研究。

表5 影响TNBC无病生存期的多因素Cox回归分析

注：*为对照组

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Correlation analysis of the effects of androgen receptor and tumor-infiltrating lymphocytes on the prognosis of triple negative breast cancer

ZHANG Jiongjiong, ZHENG Bin, SHEN Haixing, CHEN Zhan

1.Department of Thyroid and Breast Surgery, Cixi People’s Hospital, Cixi 315300, Zhejiang, China; 2.Department of Pathology, Cixi People’s Hospital, Cixi 315300, Zhejiang, China

To discuss the expression characteristics of androgen receptor (AR) and tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) in triple negative breast cancer (TNBC), the correlation between the AR and TILs, and the correlation analysis between them on the prognosis of TNBC.Clinical data of 70 patients with TNBC from Cixi People’s Hospital between June 2011 and December 2021 were collected. Immunohistochemical staining was used to detect the expression of AR, Hematoxylin-eosin staining was used to evaluate the degree of TILs infiltration，patients were followed up their health status whether recurrence or metastasis occurred. The relationship among AR, TILs and clinicopathological parameters were determined. The correlation between AR and TILs and clinical outcome were evaluated.The expression of AR was significantly associated with Ki-67 expression, whether there was vascular tumor thrombus in TNBC (<0.05); The degree of TILs infiltration was significantly associated with Ki-67 expression, whether recurrence or metastasis occurred in TNBC (<0.05); Spearman correlation analysis showed that the expression of AR and the degree of TILs infiltration were negative related (=–0.344,=0.004). Univariate Cox regression analysis showed whether there was vascular tumor thrombus, whether recurrence or metastasis occurred, AR expression and TILs infiltration in TNBC had an impact on disease-free survival (DFS) (<0.05); Multivariate Cox analysis showed regional lymphatic in TNBC had an impact on DFS (<0.05).AR has a high expression rate in TNBC with low Ki-67 expression and the presence of vascular tumor thrombi, TILs have a high degree infiltration in TNBC with high Ki-67 expression and no recurrence or metastasis. The expression of AR in TNBC is negatively correlated with the degree of TILs infiltration. Regional lymphatic is independent risk factors affecting the prognosis of TNBC. AR expression, TILs infiltration and vascular tumor thrombi are possible prognostic factors, needs more data to be conformed, indicating TNBC can be treated according AR expression and TILs infiltration degree.

Triple negative breast cancer; Androgen receptor; Tumor-infiltrating lymphocytes; Prognosis

R737

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.27.013

慈溪市农业和社会发展类科技计划项目（CN2019010）

张炯炯，电子信箱：jojo@zju.edu.cn

（2023–03–29）

（2023–09–09）