盐胁迫下丛枝菌根真菌和生物炭调节黑麦草碳氮代谢的路径❋

赵新月, 孙 萍, 陈友媛,2,3❋❋, 刘佳鑫, 王秀海,2,3❋❋

(1. 中国海洋大学环境科学与工程学院, 山东 青岛 266100; 2. 中国海洋大学海洋环境与生态教育部重点实验室,山东 青岛 266100; 3. 中国海洋大学山东省海洋环境地质工程重点实验室, 山东 青岛 266100)

土壤盐渍化是制约全球土地利用效率提高和农业生产发展的一个关键因素[1]。中国滨海重度盐渍土区域的盐度高达7以上[2],且土壤养分匮乏[3]。高盐严重阻碍了植物生长,导致植物种类稀少,景观萧条,破坏当地生态环境[4]。因此,探索有效方法提升植物的碳氮代谢活性对提高植物在重盐碱地的生存能力至关重要。

生物炭和丛枝菌根真菌(AMF)已被证明对盐渍土有较好的改良效果[5-6]。生物炭能够通过影响碳氮相关酶活性调节土壤的碳矿化和氮转化[7]。有研究认为,生物炭提高了土壤蔗糖酶活性,促进土壤有机碳矿化[8];它还提高了土壤蛋白酶等氮循环酶活性,增加养分可用性[9]。因此,生物炭添加有望提高盐胁迫下的植物生长水平,而促生机制与植物的碳氮代谢过程密切相关。

在生长发育过程中,植物吸收无机氮(如铵盐、硝酸盐)和有机氮(如氨基酸)[10],投入充足的氮进行光合作用,将CO2同化为碳水化合物;同时,在无机氮同化过程中,需要大量的碳充当反应受体[11]。而盐胁迫严重限制了上述过程中植物对碳水化合物的积累[12],影响无机氮同化和有机氮合成[13],威胁生命活动。AMF作为一种广泛存在的共生真菌,其对植物生长的促进作用主要源于对植物碳氮代谢的调控,可将植物固定的碳转移到菌丝体中以调节碳分配[14]。Shu等[15]研究了AMF定植对荔枝幼苗蔗糖代谢的影响,发现蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶保持了高活性。但是,AMF和生物炭联合作用对盐胁迫植物碳氮代谢的影响还未知,而且二者调节植物碳氮代谢关键酶活性和代谢产物转化的路径尚未得到量化。偏最小二乘路径分析(PLS-PM)可定量解释多个指标和影响路径之间的因果关系[16],在阐明环境领域污染物转化路径、多环境因子影响程度等方面具有巨大潜力[17],但目前应用较少。

本研究通过水培实验,探究盐胁迫下植物碳氮代谢关键酶及中间产物变化,分析并量化AMF和生物炭对植物碳氮代谢的影响效果与路径,主要达到以下3个目的:(1)明确不同盐胁迫条件下AMF和生物炭对植物的促生作用;(2)明确AMF和生物炭对植物碳氮代谢产物、碳氮代谢关键酶的影响;(3)通过聚类分析和PLS-PM模型,阐明AMF和生物炭调控植物碳氮代谢的作用路径。研究结果将为滨海盐碱地区植物景观恢复提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

生物炭原材料为浒苔(Enteromorphaprolifera),购买自中国海洋大学生物科技有限公司。将浒苔置于气氛炉中,以5 ℃·min-1的升温速率升温至400 ℃并停留2 h,得到浒苔生物炭,其基本特性如表1所示。AMF菌剂购买自捷克诺曼环境技术股份有限公司。多年生黑麦草,种子购买于宿迁春满园种业有限公司。

表1 浒苔生物炭的理化特性Table 1 Physicochemical properties of Enteromorpha prolifera biochar

1.2 实验设计

将黑麦草种子用6%的H2O2灭菌,并在室温下预发芽48 h,在每个花盆(10 cm×10 cm×12 cm)中加入80 g灭菌蛭石。设置不同盐度和添加物的12个处理组,各处理组实验设计见表2。最后将50粒预发芽后的种子均匀撒在蛭石表面,再用10 g灭菌蛭石均匀盖住种子,用去离子水浇透基质。将盆栽放置在光照培养箱中,保持30 ℃,24 h·d-1光照,待种子萌发率达到约50%后将培养条件改为30 ℃,16 h·d-1光照。在实验第7天对植物进行间苗,使每个花盆中留下长势相近的20株植物。为防止植物出现“盐休克”,每天增加4个单位盐度,直至达到盐度设计水平后,保持设定的0、10和20的盐度(在本文中盐度用NaCl浓度表示)。实验过程中,每天浇灌1/2强度含NaCl的Hoagland营养液20 mL。生长20 d后收获所有植物,测定植物指标。对于每个测试指标,随机从每个处理组设置的5盆重复样中取3株植物。

表2 处理组实验设计Table 2 Experimental design of the treatment groups

1.3 分析测定方法

1.3.1 菌根定植观察 使用生物显微镜(BM 2000),观察未接种与接种AMF情况下,植物根部的显微结构。

1.3.2 植物生长指标测定 收获植物前,用直尺测量植物自然状态下植株最高点到土壤的距离,即为植物株高。将植物根收获后小心地冲洗干净,用直尺测量植物根长。每盆随机收获3株植物幼苗,冲洗并拭干后测量称重,取平均值作为植物鲜重(FW)。然后,将植物在60 ℃的烘箱中干燥72 h,以获得恒定的重量,记录植物干重(DW)。植物总重量(TW)为黑暗条件下将叶片浸入蒸馏水中24 h,使得叶片吸水成饱和状态时的重量。叶片相对含水率(RWC)的测量方法如下[18]:

(1)

1.3.3 植物生理生化指标测定

1.3.3.1 植物光合色素含量测定 准确称取0.2 g新鲜叶片样品,浸泡在20 mL 80%丙酮溶液(作为浸提试剂)中,黑暗提取72 h以上,分别在663、646和470 nm下比色,以测定植物叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量[19]。

1.3.3.2 植物碳氮代谢产物测定 碳代谢产物测定:可溶性糖和淀粉含量测定采用硫酸-蒽酮比色法[20]。

氮代谢产物测定:氨基酸含量测定采用茚三酮法,可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝染色法[21]。

1.3.3.3 植物碳氮代谢酶活性测定 蔗糖合成酶(SS)和蔗糖磷酸合成酶(SPS)试剂盒购买自南京建成生物工程研究所,根据说明进行两种酶的活性测定。谷氨酰胺合成酶(GS)活性根据金等[22]方法进行测定。谷氨酸合成酶(GOGAT)活性测定根据Lin等[23]方法进行测定。

1.4 数据处理与分析

结果以平均值±标准差表示。采用SPSS 18.0对实验数据进行单因素方差分析(ANOVA),采用Duncan检验进行不同处理组间的多重比较分析(P<0.05)。使用R语言进行聚类分析,采用Smart PLS 3.0软件进行偏最小二乘路径分析(PLS-PM)[24]。其他统计数据使用Origin 2021软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫下AMF-黑麦草菌根定植情况

未接种和接种AMF处理组的植物根部生物显微镜照片见图1。从图中可以看出,不接种AMF的情况下,植物细胞呈规则排列的长椭圆形。AMF接种后成功侵染植物根部,并对根细胞的结构产生影响,在根细胞和根外可见AMF的菌丝和泡囊等结构。

图1 未接种AMF植物根部(a)和接种AMF植物根部(b)的显微照片

2.2 盐胁迫下AMF和生物炭对黑麦草生长情况的改善作用

随着NaCl浓度升高,植物的株高、根长、鲜重和相对含水率明显降低(见图2)。当NaCl浓度达到20时,植物生长受到显著抑制。NaCl浓度为0和10时,AMF和生物炭联合处理显著促进了植物生长和生物量积累(P<0.05),促生效果表现为BA>AMF>BC>CK。在NaCl浓度为10时,AMF接种和生物炭添加使得植物株高提高了31.8%和19.6%,根长提高了48.0%和38.7%,鲜重提高了59.9%和21.6%,相对含水率提高了2.9%和1.1%。

图2 不同盐度下AMF和生物炭对黑麦草株高(a)、根长(b)、鲜重(c)和相对含水率(d)的影响

2.3 盐胁迫下AMF和生物炭对黑麦草光合作用的促进作用

随着NaCl浓度升高,植物叶绿素a和类胡萝卜素含量呈现明显的下降趋势,而叶绿素b变化不显著(见图3)。在不同的盐胁迫条件下,AMF和生物炭均表现出良好的促进植物光合作用的效果,且联合处理的效果最佳。当NaCl浓度为10时,与CK组相比,BC、AMF和BA组的叶绿素a含量分别增加了25.2%、41.8%和47.8%,类胡萝卜素含量分别提高了2.2%、28.8%和10.3%。而仅在NaCl浓度为0时,AMF接种显著提高了叶绿素b的含量(P<0.05)。

图3 不同盐度下AMF和生物炭对黑麦草叶绿素a含量(a)、叶绿素b含量(b)和类胡萝卜素含量(c)的影响

2.4 盐胁迫下AMF和生物炭对黑麦草碳代谢关键酶和碳代谢产物的影响

盐胁迫显著降低了植物可溶性糖和淀粉含量,以及蔗糖合成酶活性,但对蔗糖磷酸合成酶的活性影响没有明显规律(见图4)。对于植物碳代谢关键酶和碳代谢产物的作用强度,整体表现为BA>BC>AMF>CK。NaCl浓度为10‰时,AMF、生物炭处理分别增加了蔗糖合成酶(37.3%、48.3%)和蔗糖磷酸合成酶的活性(33.9%、44.4%),二者联合应用使得两种酶活性分别增加了53.4%、66.1%。此外,可溶性糖和淀粉积累增加,与CK相比,AMF接种和生物炭添加使可溶性糖含量分别提高了36.9%和22.1%,淀粉含量分别提高了28.1%和23.2%。

2.5 盐胁迫下AMF和生物炭对黑麦草氮代谢关键酶和氮代谢产物的影响

随着NaCl浓度升高,植物的谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合成酶活性大大降低,氨基酸和可溶性蛋白的含量显著下降(见图5)。AMF和生物炭的加入均提高了氮代谢关键酶活性和氮代谢产物含量。当NaCl浓度为10时,BC和BA组的谷氨酰胺合成酶活性分别提高了36.9%和21.4%;谷氨酸合成酶的活性分别提高了31.2%和46.9%,氨基酸含量分别提高了8.2%和37.7%,可溶性蛋白含量分别提高了59.8%和110.3%。

3 讨论

AMF和生物炭在促进植物生长方面表现出良好的协同作用效果,且AMF的促生效果更佳。当NaCl浓度为0和10时,AMF侵染植物根后形成的根-菌丝网络扩大了根系的吸收面积,加速宿主植物的根组织吸收水分和养分[25]。此外,AMF和生物炭均可增加植物的叶绿素和类胡萝卜素含量,这与Yang等[26]的结果一致。菌根共生可能增加了植物叶片中的氮含量,增强了叶绿素a还原酶等的基因表达[27],从而增强植物的光合作用。AMF和生物炭发挥协同作用的原因可能是,生物炭的孔隙丰富、比表面积大,可为AMF生长提供合适的栖息地,保护AMF菌丝免受伤害[28]。Hammer等[29]研究证实,AMF和生物炭存在协同效应,能有效缓解盐分引起的植物(莴苣)的生长抑制。

采用聚类分析,探究3种不同盐度条件下,AMF和生物炭作用后黑麦草生长、生理指标之间的相关性(见图6)。在10 NaCl条件下,与对照组相比,生物炭的加入主要调节植物的碳氮代谢,提高蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶活性和淀粉含量,上调谷氨酰胺合成酶的表达;AMF接种调控了碳代谢过程,促进光合色素和淀粉的积累,提高蔗糖磷酸合成酶活性,这与前人的研究一致[30]。

(蓝色和红色分别表示正相关和负相关关系。“CK-0”、“CK-10”、“CK-20”、“BC-0”、“BC-10”、“BC-20”、“AMF-0”、“AMF-10”、“AMF-20”、“BA-0”、“BA-10”、“BA-20”表示不同的盐分浓度和处理组。各测试指标的单位同上。有关此图例中颜色参考的解释,请参考本文的web版本。Blue and rad represent positive and negative relationships, respectively. The markers “CK-0”、“CK-10”、“CK-20”、“BC-0”、“BC-10”、“BC-20”、“AMF-0”、“AMF-10”、“AMF-20”、“BA-0”、“BA-10”、“BA-20” indicate different salt conditions and treatments. Units for each test indicator are as above. For interpretation of the references to colour in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.)

(*的数量表示该模型中路径的显著性水平(***P<0.01,**P<0.05, *P<0.10)。各测试指标的单位同上。有关此图例中颜色参考的解释,请参考本文的web版本。)The number of asterisks indicates the significance level (***P<0.01, **P<0.05,*P<0.10). Units for each test indicator are as above. For interpretation of the references to colour in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.)

4 结语

在0、10和20的NaCl浓度处理的水培条件下,AMF和生物炭均显著促进了黑麦草的生长和生物量积累,极大减轻高盐胁迫造成的损伤,提高植物耐盐能力。AMF和生物炭在调节植物碳氮代谢方面存在差异,具体来说,生物炭在调节植物碳氮代谢方面的作用更强,增加碳氮代谢关键酶的活性,促进可溶性糖、淀粉等碳代谢产物,以及氮代谢产物氨基酸和可溶性蛋白的积累;AMF对于调控植物的碳代谢具有一定的积极作用,通过上调关键酶活性来增加植物的碳代谢产物。当AMF和生物炭联合作用时,表现出良好的协同作用,促进植物生长、光合作用和碳氮代谢活性,具有较高的实际应用价值。