野生多花兰的快速繁殖与保存

唐映红，文 雯，李佳娜，龙 圆，陈建荣

（1.湖南文理学院 生命与环境科学学院，湖南 常德 415000；2.长沙学院 生物与化学工程学院，湖南 长沙 410022；3.常德市人工智能与生物医药研究中心，湖南 常德 415000；4.常德市农业生物大分子研究中心，湖南 常德 415000）

多花兰（Cymbidium floribundumLindl.）又称蜜蜂兰，是兰科（Orchidaceae）兰属（CymbidiumSw.）的一种附生植物，是《濒危野生动植物种国际贸易公约》附录二物种中的一员，是国家Ⅱ级保护野生植物，国内多花兰主要分布在浙江、江西、福建、湖北、湖南、广东、广西、海南、重庆、贵州、云南等地［1］。多花兰叶革质肥厚，具有光泽，花芽易分化，花朵多达40 朵以上，色泽鲜艳，花期长，观赏价值极高［2］。多花兰根可作药用，滋阴清肺，化痰止咳［3］。多花兰株型、花朵数及花色等均有丰富的变异，能耐高温和低温，《国际兰花新品种名录（New Orchid Hybrids）》和国内发现的兰属原生种的杂交利用情况均显示多花兰杂种数量排在前5 名［4］，其在杂交育种中具有重要应用价值。然而，由于生境退化或丧失、砍伐或直接采挖等，实际的开发水平使多花兰种群在过去10 年减少大于30%［1］，野生多花兰植物资源急剧减少，加强野生多花兰及其他兰科植物的保护和种质资源的保存迫在眉睫［5］。

目前，我国栽培的国兰品种绝大多数都是由野生种类引种驯化而来。兰科以分株繁殖为主，但繁殖速度慢；兰科种子很小，内含一些发育不完全的球形胚，无胚乳，自然状态下很难萌发。自种子无菌萌发技术如建兰［Cymbidium ensifolium（L.）Sw.］［6］、蕙兰（Cymbidium faberiRolfe）［7］、蝴蝶兰（Phalaenopsis aphroditeH.G.Reichenbach）［8］等获得成功后，已建立起部分兰科植物的快繁体系，部分品种已达到产业化生产阶段，并已逐渐深入分子研究方面［9，10］。目前无多花兰种质资源保存方案的报道，有关多花兰种子无菌萌发和组织培养有少量报道，但培养基中除了添加植物生长调节剂，还多添加辣木（Moringa oleiferaLam.）叶汁、枸杞（Lycium chinenseMiller）叶汁、椰汁等营养剂［11，12］，或硝酸银或香蕉（Musa nanaLour.）等［13］，或采用升汞消毒种子，加大了繁殖成本和环境污染。因此，本研究以获得的一种野生多花兰蒴果为材料，研究其种子无菌萌发、原球茎增殖和出芽、芽生根的培养方案，拟建立和优化多花兰快速繁殖体系，并利用组织培养技术进行常规继代培养保存其种质资源，为多花兰种苗工厂化生产、多花兰科研者的野外回归工作提供重要保障，对多花兰野生资源的保护和保存具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

野生多花兰发现于湖南省桑植县野外常绿阔叶林下（图1A， B），由中南林业科技大学刘昂鉴定［14］，采其接近成熟且未开裂的蒴果（图1C， D）为外植体。

1.2 方法

1.2.1 种子无菌萌发

将多花兰蒴果用自来水冲洗后，先用75%乙醇浸泡3 min；再用2%次氯酸钠（NaClO）溶液浸泡10 min；然后无菌水浸泡冲洗6 次，每次1～2 min；最后用无菌滤纸吸干表面水分，将蒴果两端切去，剖开果实，分成多份数量相同的种子，均匀撒在培养基中。种子萌发培养基为：花宝一号（Hyponex，HP） +4.00 g·L-1蛋白胨（Peptone） + 0.10 g·L-1活性炭（Activated carbon， AC） + 琼脂（Agar），其中HP 有4 个水平：2.00、3.00、4.00 和5.00 g·L-1；琼脂有2 个水平5.00 和7.00 g·L-1。每个处理4 次重复，随机单位组设计，记录种子的污染情况、萌发时间、萌发数量和种子形态变化。

1.2.2 原球茎增殖培养

以1/2 MS 为基本培养基，设计α-萘乙酸（α-Naphthalene acetic acid， NAA）、6-苄基腺嘌呤（6-Benzylaminopurine， 6-BA）和水解乳蛋白（Lactalbumin hydrolysate， LH）3 个因素，每个因素设4 个水平，NAA 浓度为0.00、0.50、1.00 和2.00 mg·L-1，6-BA和LH 浓度均为0.00、1.00、2.00 和3.00 mg·L-1，进行正交试验，每个处理2次重复，随机单位组设计。培养30 d 后统计增殖率（%） = 增殖的原球茎个数 / 接种的原球茎个数 × 100。

1.2.3 原球茎分化出芽培养

以原球茎为材料、1/2 MS 为基本培养基，添加NAA 浓度为0.01、0.50 和1.00 mg·L-1，6-BA 浓度为1.00、2.00 和3.00 mg·L-1，每个处理3 次重复，随机单位组设计。培养30 d 后统计单个原球茎的出芽个数。

1.2.4 多花兰种质资源的保存

将多花兰原球茎分化出的芽，转接到保存培养基中。以1/2 MS 为基本培养基（含7.00 g·L-1琼脂和20.00 g·L-1蔗糖），NAA 浓度为0.00、0.50、1.00 和2.00 mg·L-1，6-BA 和LH 浓度均为0.00、1.00、2.00 和3.00 mg·L-1，设计16 组试验，每个处理2 次重复，随机单位组设计。统计芽增殖倍数 = 增殖后的芽个数 / 接种的芽个数、芽生根率（%） = 生根的芽数 / 接种的芽数 × 100、芽生长高度。

1.2.5 培养条件

除特殊说明外，上述培养基中均含30.00 g·L-1蔗糖，5.00 g·L-1琼脂，pH值为5.4～5.6，培养温度25 ±1℃，光照时间为白天/黑夜12 h / 12 h，光照强度为1 000 Lx。种子萌发先置于黑暗下培养30 d 后，再转入光照培养，光照强度为2 000 Lx。

1.2.6 统计分析

试验数据用平均值±标准误差表示，采用SPSS 26.0 软件进行方差分析，采用新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对种子无菌萌发的影响

F 测验结果显示（表1），各因子的效应主次为HP ＞ 琼脂，其中琼脂的效应无显著性。显著性测验显示，HP 的4 个水平差异显著，以3.00 g·L-1种子萌发效果最佳，种子萌发数量为43.88，显著高于其他水平，其他3 个水平之间无显著差异。HP 与琼脂存在互作，以处理组3种子萌发效果最佳，最适培养基为：3.00 g·L-1HP + 4.00 g·L-1蛋白胨 + 0.10 g·L-1AC +5.00 g·L-1琼脂，培养60 d 后种子萌发数量为55.25（萌发率约55.00%）（表2）。乳白色种子膨大形成浅绿色或深绿色的圆球（图1E），然后将圆球转移到新的培养基中继续培养30 d 后，大部分绿色圆球形成愈伤组织（图1F）或原球茎（图1G）。

表1 不同培养基对种子无菌萌发的方差分析Tab.1 Variance analysis of different medium on aseptic germination of seeds

表2 不同培养基对种子无菌萌发的影响（培养60 d）Tab.2 Effects of different medium on aseptic germination of seeds（60 d）

2.2 不同激素及其配比对原球茎增殖的影响

F 测验结果显示（表3），各因子的效应主次为NAA ＞ 6-BA ＞ LH，各因子的效果均极显著。

表3 6-BA、NAA和LH对原球茎增殖的方差分析Tab.3 Variance analysis of NAA， 6-BA and LH on protocorm proliferation

各效应显著性测验显示，NAA、6-BA 和LH 的4个水平均差异显著，均以1.00 mg·L-1增殖效果最好，显著高于其他水平（表4）。不同激素浓度配比间产生正互作使得增殖率升高，以处理组9增殖率最高，达94.00%，显著高于其他处理组（表5），且原球茎基部膨大，原球茎增殖明显、较大且紧促（图2A）。其次为处理组11，增殖率约81.50%，且个别原球茎有少量出芽（图2B）。不同激素浓度配比间产生负互作使得增殖率下降，处理组8 仅为1.25%，仅1/2 MS培养基则无增殖（图2C）。综上所述，多花兰原球茎增殖的最适培养基为：1/2 MS + 1.00 mg·L-1NAA +2.00 g·L-1LH，培养30 d增殖率达94.00%。

图2 多花兰原球茎增殖培养Fig.2 Propagation culture of protocorm of C. floribundum

2.3 6-BA 和NAA 及其配比对原球茎分化出芽的影响

根据前期原球茎增殖有出芽情况的研究基础，设计6-BA和NAA 2个因素3个水平的原球茎分化出芽培养方案。F测验结果显示（表6），各因子的效应主次为NAA ＞ 6-BA，其中6-BA的效应无显著性。

表6 6-BA和NAA对原球茎分化出芽的方差分析Tab.6 Variance analysis of NAA and 6-BA on protocorm budding

显著性测验显示，NAA的3个水平差异显著，对原球茎分化出芽的效果呈先增后减的趋势，以0.50 mg·L-1出芽效果最好，单个原球茎分化约5 个芽，显著高于其他水平。6-BA 和NAA 之间存在互作效应，以处理组4分化出的芽数最多，单个原球茎分化约8个芽（表7）。综上所述，多花兰原球茎分化出芽的最适培养基为：1/2 MS + 0.50 mg·L-1NAA +1.00 mg·L-16-BA，培养7 d 后，单个原球茎同时分化出多个芽点（图3A），培养30 d 后，芽伸长约1～2 cm（图3B）。培养30 d后更换新的培养基继续培养，原球茎增殖并不断分化出新的芽，芽叶片展开（图3C）。

图3 多花兰原球茎分化出芽的培养过程Fig.3 Process of protocorm differentiation and budding of C.floribundum

表7 不同培养基对原球茎分化出芽的影响（培养30 d）Tab.7 Effects of different media on protocorm budding（30 d）

2.4 多花兰种质资源的保存研究

不同处理对芽生根、增殖和伸长均表现出极显著。培养5 个月后，处理13 对芽生根和伸长效果均较好，芽生根率为92.50%、芽增殖倍数约为8.50、芽伸长约4.35 cm；处理9 芽增殖效果最好，增殖倍数约为9.07。仅1/2 MS 的培养基芽生根率和芽伸长均是最低的，且无芽增殖情况（表8）。因此，综合考虑，选择多花兰组培苗保存的最适培养基为1/2 MS + 2.00 mg·L-1NAA。将单个芽（图4A）接种在最适保存培养基中，培养前3 个月，芽生长较快，芽伸长4 cm 左右，之后开始出现根点（图4B），芽增殖和伸长较慢，根点不断伸长，培养5 个月之后根伸长约1 cm，根呈乳白色或浅绿色（图4C）。直至6 个月后组培苗因营养不够的原因，开始慢慢褐化死亡，因此6 个月后应及时更换新的培养基继续保存组培苗。此外，最适保存培养基中加入1.00 g·L-1AC 时，芽增殖和生根率基本保存不变，但芽生根时间缩短为30 d，基部形成的根较长，呈深绿色（图4D）。

图4 多花兰种质资源的保存Fig.4 Conservation of Germplasm Resources of C. floribundum

3 讨论

从古至今，我国栽培兰花已有2000 年的历史，尽管历史悠久，但由于某些兰花的人工栽培体系至今还不成熟，所以对兰花的利用基本仍是从自然界直接索取获得。因此，加强对兰科植物的研究至关重要［15］。根据兰花产业化发展的需求，着重从种质资源创新和产业化生产关键技术两个方面开展工作，通过组织培养技术培育和保存种质资源是一种有效的方式［16］。目前已经有70 个属的兰花植物可采用组织培养技术进行快速繁殖，大量洋兰的组织培养和工厂化得到了发展，部分国兰也在组织培养方面的研究取得了很大的成功［15］。有关多花兰组织培养研究报道较早，其野生种质资源的快速繁殖缺乏研究报道。本研究从种子的无菌萌发到获得组培苗进行快速繁殖。多花兰种子从接种到胚开始转绿的培养时间为60 d，相比唐凤鸾等［17］研究的多花兰种子萌发时间缩短30 d 左右、萌发率差异不大。值得注意的是本研究多花兰原球茎分化出芽途径是小球体经原球茎发育成小苗，与冬凤兰（Cymbidium dayanumRchb.F）和多花脆兰等类似，但比多花脆兰［Acampe rigida（Buch.-Ham.ex J.E.Smith） P.F.Hunt］形成小球体（40～45 d）培养时间短［18］，不同于其他大多数兰科的根状茎分化出芽途径。最优多花兰增殖培养基培养30 d 后的原球茎增殖率为90.00%（增殖倍数约9），相比已报道的多花兰原球茎增殖培养基，如：王郑昊等［11］培养90 d增殖倍数5.50、唐凤鸾等［17］培养的增殖倍数6.5倍/60 d、丁长春等［13］培养的增殖率82.00%/60 d，本研究在增殖倍数和增殖时间上得到明显优化。本研究获得的最优生根培养基培养30 d左右生根率达92.50%，比唐凤鸾等［17］培养50 d生根率100%的生根时间要缩短较多。

兰科种质资源的保存主要有栽培保存、离体保存（无菌保存）、花药、种子和DNA 保存等形式［21］，有低温、玻璃化保存等技术［22，23］。但不管哪种保存形式都有其优点和缺陷，较为理性的的保存方式则是结合栽培保存和离体保存，通过栽培保存的方式为离体保存提供稳定保存品种特性的材料，为离体保存材料的更新提供保障；通过离体保存节约种质资源圃所需要的空间、人员等投入，同时也能够为所栽培的种质材料提供更新换代的材料［21］。目前关于多花兰种质资源的保存缺乏报道。本研究获得的保存培养基1/2 MS + 2.00 mg·L-1NAA（含7g·L-1琼脂和20 g·L-1蔗糖），不同于与大多数其他兰科的保存培养基，如铁皮石斛（Dendrobium candidumLindl.）、苞舌兰（Spathoglottis pubescensLindl.）使用1/2 MS，独蒜兰［Pleione bulbocodioides（Franch.） Rolfe］则为MS + 1 mg/L BA + 2 mg/L NAA + 0.5 g/L AC［22］。

此外，本研究筛选的培养基仅使用基本培养基添加6-BA、NAA 和/或LH［24］，相比其他研究中除了添加植物生长调节剂外，还不同程度的添加了马铃薯（Solanum tuberosumL.）水煮液、硝酸镧、硝酸银、椰乳、椰汁和活性炭等其他试剂［2，11，13，17］，大大减少了繁育成本。

4 结论

综上所述，一方面，相比已报道的其他兰科的组培快繁技术，本研究建立的多花兰组培快繁体系，在种子萌发、原球茎增殖和分化出芽、芽生根等的时间和数量上均得到一定的优化，从种子萌发到获得大量组培苗仅需120 d左右，种子萌发途径也不同于大多数兰科，大大减少了繁育成本，降低了对环境的污染，为多花兰种苗工厂化生产提供依据。另一方面，获得了多花兰丛生芽同时缓慢生长、增殖和生根的培养方案，能够保证1颗丛生芽在50 mL培养基中生长6 个月左右，并获得约10 棵的多花兰组培苗，保证了多花兰种质资源的长期保存，对多花兰野生资源的保护和保存具有重要意义。