覆盖对连作半夏根际土壤微生物多样性的影响

罗 敏，章文伟，徐 广，罗 川，卢胜鄂，任星宇，邓才富*

（1.重庆市药物种植研究所 重庆 南川408400；2.重庆中医药学院，重庆 璧山402760）

半夏来源于天南星科（Araceae）植物半夏［Pinellia ternata（Thunb.） Breit.］的干燥地下块茎，是一味应用广泛的大宗传统中药材，为我国药材市场上的主流品种。半夏入药历史悠久，已有两千多年的临床用药历史，且倍受历代医家推崇。据中国医学科学院统计，在558种传统中药处方中，半夏为最广泛应用的30种中药之一，其使用频率居第22位［1］。

半夏野生资源近于枯竭，人工栽培虽在多省有发展，但多年连续种植半夏导致土壤环境恶化，人工种植发生严重的连作障碍，成为制约半夏产业发展的重要原因。随着栽种药用植物年龄增加或重茬、连作，植物生长欠佳，中药材质量和产量大幅度下降，如三七、人参、当归、地黄等［2-5］，已成为制约中药材产业发展的老大难问题。目前缓解中药材连作障碍的主要方法包括合理耕种模式、土壤管理及生物防治等。研究表明，通过调整根际微生态环境可以从根源上抑制病原菌的生长，从而缓解连作问题［6-8］。因此，本研究以连续种植2 年的半夏根际微生物为研究对象，探究覆盖措施对半夏根际土壤微生物多样性的影响，以期为寻求半夏连作障碍的缓解措施提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

半夏种源购买自贵州省毕节市，经重庆市药物种植研究所邓才富研究员鉴定为天南星科植物半夏。

1.2 试验设计

试验地位于重庆市南川区三泉镇铁桥种植基地，海拔620 m，前茬作物为厚皮菜。试验设4 个处理：常规栽种（T1）、稻草覆盖（T2）、玉米秆覆盖（T3）、对照未栽种（CK），各3 次重复；每小区起垄栽种，垄宽1.3 m，长1.0 m，半夏行距15 cm，株距8 cm，覆土5 cm。第1年春季栽种，出苗、倒苗2次；第2年春出苗前实施覆盖措施（年前未采挖，覆盖前人工拔草），玉米秆（截成垄面宽度）、稻草密集在垄面覆盖一层，约厚2 cm；大田管理同常规管理。供试土壤样品为试验地小区连作2 年的半夏根际土壤，于第2 年秋季采集；CK 于同地块未栽种区五点法采集；土壤采集后捡去植物残体等，装入封口袋，避光存储，带回室内分析。

1.3 T-RFLP分析

采用末端限制性片段长度片段多态性（T-RFLP）技术分析土壤细菌、真菌菌群结构，具体方法如下。

1.3.1 土壤微生物群落总DNA提取

采 用 Fast DNA Spin Kit for Soil（Qbiogene，Carlsbad， CA，USA）提取半夏根际土壤总DNA，方法参照试剂盒说明书。

1.3.2 土壤细菌16S rDNA及真菌ITS区PCR扩增

土壤细菌16S rDNA 扩增引物为27F（5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG -3’）与1492R（5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’）［9］。反应体系：25 μL PCR Master Mix，1 μL DNA模板，引物（10 pmol·μL-1）各0.5 μL，加入ddH2O 至终体积50 μL。反应程序：94℃预变性4 min，再94℃变性30 s，后55℃退火30 s，温度72℃延伸1 min，共进行30 个循环，再72℃延伸10 min，最终于4℃恒温保存。取2.0 μL PCR 扩增产物，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，自动凝胶成像系统（Gel Doc Documentation System， Bio-Rad， USA）拍照检测。

土壤真菌ITS 区PCR 扩增引物为ITS1（5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’）与ITS4（5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’）［10］。 反应体系：25 μL PCR Master Mix，1 μL DNA 模板，引物（10 pmol·μL-1）各0.5 μL，加入ddH2O 至终体积50 μL。反应程序：94℃预变性4 min，94℃变性30 s，后55℃退火30 s，温度72℃延伸1 min，共进行30个循环，再72℃延伸10 min，最终于4℃恒温保存。取2.0 μL PCR扩增产物，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，自动凝胶成像 系 统（Gel Doc Documentation System，Bio-Rad，USA）拍照检测。

1.3.3 PCR 产物酶切处理

细菌采用限制性内切酶HhaI 和HaeⅢ对纯化后的PCR 产物进行酶切。反应体系：限制性内切酶（10 U）1 μL，相应缓冲液1 μL，PCR 产物7 μL，超纯水补足至10 μL。反应条件：限制性内切酶在37℃水浴中温育12 h，酶切完毕后65℃水浴20 min 终止反应。真菌采用限制性内切酶HhaI 对纯化后的PCR产物进行酶切。反应体系：限制性内切酶（10 U）1 μL，相应缓冲液1 μL，PCR 产物7 μL，超纯水补足至10 μL。反应条件：限制性内切酶在37℃水浴中温育12 h，酶切完毕后65℃水浴20 min 终止反应。将酶切产物送至擎科生物有限公司（成都）进行基因扫描测序。

1.3.4 数据整理

选择TRF 的一般原则是：峰高 ＞ 80，相对误差不超过10%。T-RFLP 图谱中限制性片段（T-RF）范围细菌在35～550 bp，荧光值超过100 RFU，在平行试验的图谱中重复再现的峰纳入统计分析，并去除OTU 丰度 ＜ 1%的T-RF。T-RFLP 图谱中每1 个限制性片段（T-RF）为1 个OTU，T-RF 段大小 ± 1 bp 被认为是同一个OTU。

1.4 统计分析

T-RFLP 图谱中OTU 的数目及其丰度用PCORD程序进行多样性指数计算，包括多样性指数（Shannon diversity，H）、均匀度指数（Shannon evenness，E）及丰富度指数（Species richness index，SR）［11］。土壤理化性质、T-RFLP 测定结果均为3 次重复的平均值。使用SPSS 20.0 统计软件，数据采用统计描述、方差分析（One-way ANOVA）、Duncan 检验和Pearson 相关分析。采用 CANOCO4.5 中的冗余法（Redundancy analysis， RDA）分析群落结构与土壤理化性质［11］。

2 结果与分析

2.1 连作半夏根际土壤细菌和真菌T-RFLP多态性分析

采用T-RFLP 技术对细菌群落结构分析如图1所示。采用Hha I 和HaeⅢ 酶切得到5 种T-RFs 优势片段。常规栽种T1 处理170 bp、190 bp 菌种占优势地位；稻草覆盖T2处理170 bp、214 bp菌种占优势地位；玉米秆覆盖T3处理170 bp、190 bp 和214 bp 菌种占优势地位；未栽种CK 处理 214 bp 菌种占优势地位。与未栽种CK 相比较，连作后常规栽种T1 未出现214 bp 菌种，连作后214 bp 菌种消失了，而经稻草覆盖T2 和玉米秆覆盖T3 处理后又出现该菌种，并成为优势菌种。

图1 连作半夏不同措施下根际土壤细菌群落的T-RFLP多态性分析Fig.1 T-RFLP polymorphism analysis of rhizosphere soil bacterial community under different continuous cropping Pinellia ternata treatments

采用T-RFLP 技术对真菌群落结构分析如图2所示。采用Hha I 酶切得到6 种T-RFs 优势片段。常规栽种T1处理317 bp菌种占优势地位，稻草覆盖T2 处理214 bp 和317 bp 菌种占优势地位，玉米秆覆盖T3处理317 bp、383 bp菌种占优势地位，未栽种区域CK处理214 bp 、383 bp菌种占优势地位。常规栽种T1、稻草覆盖T2和玉米秆覆盖T3均有317 bp菌种为优势菌种，与未栽种区域CK 相较，说明半夏连作后317 bp 菌种不断繁殖扩大，逐渐成为优势菌种。而通过稻草覆盖和玉米秆覆盖之后，原优势菌种214 bp 和383 bp 菌种逐渐扩大并有占据优势的趋势。

图2 连作半夏不同措施下根际土壤真菌群落Hha I酶切的T-RFLP多态性分析Fig.2 T-RFLP polymorphism analysis of fungal community in rhizosphere soil under different measures of continuous cropping Pinellia ternata treatments

2.2 连作半夏根际土壤细菌和真菌多样性分析

以T-RFLP 图谱为基础，连作半夏不同覆盖措施下根际土壤细菌和真菌多样性分析结果如表1和2 所示。由表1 可知，连作后常规栽种T1 与未栽种区域CK 相较，半夏连作2 年后其根际土壤细菌的Shannon 多样性指数和均匀度均呈下降趋势，但二者间差异不显著。由表2 可知，连作后常规栽种T1与CK 相较，半夏连作2 年后其根际土壤真菌的Shannon 多样性指数、均匀度指数和丰富度指数均呈上升趋势，且连作后常规栽种T1的根际土壤真菌Shannon 多样性指数和丰富度指数均显著高于未栽种区域CK（P＜ 0.05）。以上表明，半夏连作后其根际土壤细菌多样性水平下降，土壤真菌多样性水平升高，土壤微生物出现从细菌型向真菌型转化的趋势。

表1 连作半夏不同措施下根际土壤细菌多样性指数Tab.1 Bacterial diversity index of rhizosphere soil under different continuous cropping measures

表2 连作半夏不同措施下根际土壤真菌多样性指数Tab.2 Diversity index of fungi in rhizosphere soil of continuous cropping Pinellia ternata

比较不同覆盖措施，土壤细菌多样性和丰富度表现为T2 ＞ T3 ＞ CK ＞ T1，经稻草和玉米秆覆盖之后，连作半夏根际土壤细菌菌群的Shannon 多样性指数和丰富度指数明显升高，高于常规栽种T1和未栽种区域CK，且与常规栽种T1 间差异达显著水平（P＜ 0.05）；而根际土壤真菌菌群的Shannon 多样性指数表现为T1 ＞ T3 ＞ T2 ＞ CK，且稻草覆盖T2 与玉米秆覆盖T3 均显著低于常规栽种T1。以上标明，通过覆盖稻草或玉米秆后，连作半夏根际土壤微生物菌群发生了改变，细菌多样性水平升高，真菌多样性水平有所下降，逐渐调节了土壤微生物菌群的转化趋势。

2.3 连作半夏根际土壤细菌和真菌群落与土壤养分的关联分析

运用RDA 分析进行不同处理半夏根际土壤细菌群落结构与土壤养分参数的相关性分析，获得二者关系图，如图3 所示。冗余分析图中箭头表示环境因子，箭头所处的象限表示环境因子与排序轴间的正负相关性，箭头连线长度代表某个环境因子与样本分布相关程度的大小。连线越长，相关性越大，代表这个环境因子对研究对象的分布影响越大；反之越小。箭头连线与排序轴的夹角代表着某个环境因子与排序轴的相关性大小，夹角越小，相关性越高；反之越低［12］。

图3 连作半夏根际土壤细菌菌落与土壤养分的冗余分析Fig.3 Redundancy analysis of bacterial colony and soil nutrient in rhizosphere soil of continuous cropping Pinellia ternata

分析结果显示，第1 排序轴的特征值为0.751，第2排序轴特征值为0.024。由图3可知，第1排序轴与N 关系最为密切，均达到极显著水平（P＜ 0.01）。本试验中N 对细菌群落结构的影响最显著（P＜0.05，蒙特卡罗算法）。

运用RDA 分析进行不同处理半夏根际土壤真菌群落结构与环境参数的相关性分析，获得二者关系图，如图4 所示。分析结果显示，第1 排序轴的特征值为0.856，第2 排序轴特征值为0.009。由图4 可知，第1 排序轴与N 关系最为密切，均达到极显著水平（P＜ 0.01）。本试验中N 对真菌群落结构的影响最显著（P＜ 0.05）。

图4 连作半夏根际土壤真菌菌落与土壤养分的冗余分析Fig.4 Redundancy analysis of fungi colony and soil nutrient in rhizosphere soil of continuous cropping Pinellia ternata

3 讨论与结论

3.1 连作对半夏根际土壤细菌和真菌多样性的影响

土壤微生物多样性及其组成的改变会打破根际土壤微生态系统功能，破坏土壤健康，土传病害等加剧，进而影响作物的产量和品质［13-15］。连作障碍的发生与根际微生态系统的失衡密切相关，长期连作可导致根际微生物群落结构和功能多样性的改变［16，17］，且病原菌增加，益生菌减少，影响了土壤的生产力［16，18］。

本试验结果表明，半夏连作后，其根际土壤细菌和真菌菌群的多样性水平发生了变化，细菌的多样性水平呈下降趋势，而真菌的多样性水平则呈现相反的变化趋势。相关研究表明，连作会导致微生物区系组成发生变化，由细菌型土壤向真菌型土壤转变；细菌型土壤是土壤肥力提高的一个生物指标，而真菌型土壤是地力衰竭的一个标志［19］。随着连作年限的增加，土壤质量逐渐变差，细菌菌群结构简单、多样性水平下降，真菌则升高［20］。本试验的研究结果与之相一致。由此可见，半夏连作改变了土壤细菌、真菌的菌群结构及多样性水平，这可能是半夏连作障碍发生的主要原因之一。因此，进一步研究连作对土壤微生物功能及活性的影响，可为减缓连作障碍提供重要的科学依据。

3.2 覆盖对连作半夏根际土壤细菌和真菌多样性的影响

相关秸秆覆盖的研究结果发现，与不覆盖的耕作方式相比，玉米秸秆覆盖会改变土壤中微生物的种类和结构，改善土壤质量，可在植物生长过程中持续提供营养物质［21］；稻草覆盖后土壤细菌丰富度和Shannon 多样性指数增加，稻草覆盖措施是增加土壤细菌多样性的主要影响因素［22，23］，可显著增加土壤微生物数量［24］。本研究覆盖试验结果表明，通过覆盖玉米秆或者稻草后，连作半夏根际土壤微生物群落结构发生了改变，与连作后常规栽种相比较，细菌菌群的多样性水平显著提高，而真菌菌群多样性水平明显下降，这说明秸秆覆盖措施对连作后土壤微生物菌群的改变具有一定调节作用，这一发现或许能够为进一步研究连作障碍的缓解措施提供思路与前期基础。另外，相关研究表明，土壤微生物群落与土壤氮含量呈极显著相关［25］。本实验中也发现土壤氮对根际土壤细菌和真菌群落结构具有显著影响，说明土壤氮是影响微生物生长和发育的重要因素，那么是否可以进一步研究土壤氮对微生物的影响机制，进而通过调节土壤氮含量来调控土壤微生态环境，以此来缓解连作导致的土壤微生态失衡问题；以上推测将有待综合多学科进行深入研究与解释。

综上所述，半夏连作后，根际土壤细菌多样性水平下降，土壤真菌多样性水平升高，土壤微生物出现从细菌型向真菌型转化的趋势；玉米秆或者稻草覆盖对连作半夏土壤微生物菌群的改变具有一定调节作用，细菌多样性水平显著提高，真菌多样性下降，且能够恢复原优势菌种；秸秆覆盖对连作土壤微生态失衡具有一定缓解效果；土壤中氮含量对根际土壤细菌和真菌群落结构具有显著影响，土壤氮是影响微生物生长和发育的重要环境因素。