葡萄卷叶伴随病毒-3 RT-LAMP检测体系的建立与应用

张强强 王雯雯 闫思远 李 玲 王若彤 顾沛雯 ，

（1宁夏大学林业与草业学院，宁夏 银川 750021；2宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021）

葡萄卷叶病是目前在世界范围内发生最普遍，且造成经济损失最大的葡萄病毒病［1］。引起卷叶病的病原是葡萄卷叶病相关的病原物（grapevine leafrollassociated viruses，GLRaVs），目前已被报道的有6 种，分别为GLRaV-1、GLRaV-2、GLRaV-3、GLRaV-4（包括GLRaV-4 的变种GLRaV-5、-6、-9、-Pr、-De、-Car）、GLRaV-7 和GLRaV-13［2-3］。其中GLRaV-3 是发生最为普遍，且危害最大的病原之一［4］。研究表明，GLRaV-3 能抑制葡萄的生长发育，改变葡萄叶片的生理代谢，降低葡萄光合速率，造成葡萄减产，品质变劣，严重影响葡萄酒的口感。Maree 等［5］发现葡萄感染卷叶病毒后，严重影响树势并缩短树体的生命周期。Halldorson 等［6］研究表明，酿酒葡萄品种美乐感染GLRaV-3 后，造成叶片变红，糖分积累减少，净光合速率降低。进一步的研究发现GLRaV-3 感染葡萄能中断正常浆果的成熟过程，降低果粒中花色苷合成和糖代谢等基因的表达量，造成果实总糖、总酚、叶绿素和花色苷含量显著减低，含酸量增加，严重影响葡萄的经济价值［7-8］。葡萄一旦感染GLRaVs便终生带毒［1］，难以根治，因此建立高效、快速和准确的GLRaVs 检测体系是病害早期诊断与防控的关键。

逆转录环介导恒温扩增技术（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）是由Notomi 等［9］于2000 年开发的在恒温条件下快速完成靶标基因扩增的新方法。该方法利用1 对内引物FIP/BIP 和1 对外引物F3/B3，在具有链置换活性的Bst DNA 聚合酶的作用下，于恒温条件下催化新链的合成，从而实现高效扩增的目的［10-11］。目前，RT-LAMP已应用于葡萄病毒的快速检测。张永江等［12］建立了葡萄病毒A（grapevine virus A，GVA）的RT-LAMP 检测方法，该方法特异性好，检测所用时间仅为常规逆转录PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）的1/3，且灵敏度是常规RT-PCR 的10 倍。范旭东等［13］建立了沙地葡萄茎痘相关病毒（grapevine rupestris stem pitting-associated virus，GRSPaV）的RTLAMP 检测方法，该方法能够检测出GRSPaV 的RNA最大稀释倍数为10-4，具有简便、快速、灵敏和可视化等特点。Walsh 等［14］在2013 年开发了一种GLRaV-3逆转录环介导等温扩增检测方法，该方法直接以RNA为模板，在LAMP 体系中加入禽成髓细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus，AMV）逆转录酶，在60 ℃恒温条件下反应2 h 内完成检测。但GLRaV-3 作为RNA 病毒，具有高度变异性，不同国家不同地区的GLRaV-3 分离物的基因序列存在明显差异［15-17］，因此，针对我国范围内GLRaV-3的分离物建立快速灵敏RT-LAMP检测方法十分必要。鉴于此，本研究根据我国GLRaV-3CP基因的全长序列设计并合成特异性引物，通过优化扩增体系和反应条件，检验该方法的特异性、灵敏性和实用性，构建GLRaV-3的RT-LAMP 检测技术体系，以期为GLRaV-3 的快速、准确诊断提供方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

前期研究发现，贺兰山东麓蛇龙珠葡萄感染病毒病最为严重，经RT-PCR鉴定其主要感染葡萄卷叶伴随病毒1～3（GLRaV-1～3）、葡萄扇叶病毒（grapevine fanleaf virus，GFLV）、沙地葡萄茎痘相关病毒（GRSPaV）、葡萄病毒A（GVA）、灰皮诺葡萄病毒（grapevine pinot gris virus，GPGV）和葡萄浆果内坏死病毒（grapevine berry inner necrosis virus，GINV）［18］。本试验以感染这8种葡萄病毒的蛇龙珠葡萄叶片为阳性对照，于2021 年9 月采自宁夏青铜峡市西鸽酒庄。以脱毒蛇龙珠葡萄组培苗叶片为阴性对照（NC），由宁夏农垦玉泉营葡萄苗木繁育中心提供。

1.2 主要仪器与试剂

Simpli Nano 超微量分光光度计（GE Healthcare 公司，美国）；3K 15 通用台式冷冻离心机（Sigma 公司，美国）；T 100TM Thermal Cycler PCR 仪（Bio-Rad 公司，美国）；电泳仪（北京六一厂）；c200 凝胶成像系统（Azure Biosystems 公司，美国）；Blook 蓝光透照仪（Genedirex台湾德怡科技有限公司）；LE204E 电子分析天平（Mettler-toledo公司，瑞士）。

Plant RNA Kit R6827 植物RNA 提取试剂盒（Omega Bio-tek 公司，美国），PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 反转录试剂盒（TaKaRa 公司，日本）；Bst DNA 聚合酶（北京聚合美生物科技有限公司）；甜菜碱（上海生工生物工程有限公司）；SYBR Green I（上海瑞楚生物公司）；dNTP Mixture（上海BBI生命科学有限公司）。

1.3 引物设计与合成

根据GLRaV-3 的CP基因序列（GenBank 登录号：KC477128.1），利用Primer Explorer V5（http：//primerexplorer.jp/lampv5e/index.html）软件，根据引物长度、引物自由能及GC 含量等筛选，设计了3 组RTLAMP 引物，GLRaV-3 常规RT-PCR 引物采用F/R，扩增片段大小为942 bp［19］（表1）。上述所有引物均由上海生工生物工程技术服务公司合成。

表1 用于GLRaV-3检测的RT-LAMP和RT-PCR引物Table 1 Primers used in RT-LAMP and RT-PCR of GLRaV-3

1.4 RNA 提取及cDNA合成

将采集的葡萄叶片加入液氮迅速研磨至粉末状，取100 mg至1.5 mL离心管中，按照植物RNA提取试剂盒提取葡萄叶片总RNA，采用反转录试剂盒反转录成cDNA。

1.5 RT-PCR检测

PCR 扩增反应体系50 μL：cDNA 2 μL，正、反向引物各2 μL，Max Taq 酶25 μL，RNase-free Water 19 μL。PCR 扩增条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 变性1 min，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35 个循环；72 ℃终延伸10 min。使用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物后，将PCR 产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序。

1.6 RT-LAMP引物初筛

参照李华伟等［20］的方法建立RT-LAMP 反应体系，并略作调整。以GLRaV-3 DNA 为模板，进行RTLAMP 扩增，对表1 中3 组引物（GLRaV3-LAMP-Ⅰ、-Ⅱ和-Ⅲ）进行筛选，以脱毒蛇龙珠葡萄组培苗叶片为阴性对照，ddH2O 为空白对照。反应体系为25 μL：10×Reaction Buffer 2.5 μL，100 mmol·L-1MgSO41.5 μL，5 mol·L-1甜菜碱5 μL，10 mmol·L-1dNTPs 2.5 μL，8 U·μL-1Bst DNA 聚合酶1 μL，40 μmol·L-1FIP/BIP 1 μL，10 μmol·L-1F3/B3 1 μL，cDNA 1.5 μL，ddH2O 补足至25 μL。反应条件为：65 ℃恒温扩增60 min。

RT-LAMP 扩增结果的判断：通过2.5%琼脂糖凝胶电泳观察反应结果（阳性为梯状条带；阴性无明显条带）；反应前在管盖上加入SYBR Green I 荧光染液，反应结束后离心，分别在自然光和蓝光透照仪观察反应管的颜色变化（阳性为绿色、有荧光；阴性为橙红色、无荧光）［21-22］。

1.7 RT-LAMP引物特异性检验

使用筛选出的引物对提取的8种葡萄病毒RNA进行RT-LAMP 扩增，以脱毒蛇龙珠葡萄组培苗叶片为阴性对照，ddH2O 为空白对照。检测引物特异性。反应结果判断方法同1.6。

1.8 RT-LAMP反应体系优化

根据反应条件对RT-LAMP反应体系进行优化，依次对反应时间（30、45、60、75、90、105 min）、反应温度（61.0、61.5、62.3、64.0、65.4、66.7、67.6、68.0 ℃）、Mg2+终浓度（2、4、6、8、10、12、14 mmol·L-1）、dNTPs终浓度（0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mmol·L-1）、甜菜碱终浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mol·L-1）和Bst DNA聚合酶终浓度（0.16、0.24、0.32、0.40、0.48、0.56、0.64 U·μL-1）进行优化。反应结果判断方法同1.6。

1.9 RT-LAMP和RT-PCR灵敏度比较

用超微量分光光度计测定提取GLRaV-3 的总RNA 浓度，使用DEPC 水将总RNA 原液依次稀释10-1～10-7倍，分别进行RT-LAMP 和RT-PCR 扩增，对两种方法的检测结果进行分析，反应结果判断方法同1.6。

1.10 田间样品检测

随机采集了宁夏西鸽酒庄、新牛庄园和西夏王酒庄的蛇龙珠葡萄样品15 份，以脱毒蛇龙珠葡萄组培苗叶片为对照。按照1.4的方法提取葡萄叶片总RNA并反转录成cDNA，使用优化后的RT-LAMP 体系进行扩增，反应结果判断方法同1.6。

2 结果与分析

2.1 引物初筛

利用GLRaV-3 特异性引物对样品RNA 进行RTPCR 扩增，扩增片段与预期扩增片段大小一致（图1-A），扩增产物经测序比对确定为GLRaV-3。以所得GLRaV-3 的cDNA 为模板，对3 对引物进行筛选，引物Ⅰ和Ⅲ均能扩增出明亮清晰的梯状条带，引物Ⅱ无清晰条带出现（图1-B）。加入SYBR GreenⅠ荧光染液后，引物Ⅰ和Ⅲ的反应底物变为绿色，引物Ⅱ与对照一样为橙红色（图1-C）。在蓝光仪下，引物Ⅰ和Ⅲ发出白色亮光，引物Ⅱ无明显荧光（图1-D）。

图1 RT-LAMP引物筛选Fig.1 RT-LAMP primer screening

2.2 特异性检测

使用引物Ⅰ和Ⅲ分别对带有GFLV、GLRaV-1、GLRaV-2、GLRaV-3、GRSPaV、GVA、GPGV、GINV 的样品总RNA 进行RT-LAMP 扩增。结果如图2 所示，引物Ⅰ只有GLRaV-3 扩增出清晰明亮的梯状条带且有明显荧光，其他病毒以及对照均未扩增出梯状条带（图2-A～C）。引物Ⅲ能扩增出GLRaV-1、GLRaV-2、GLRaV-3、GRSPaV、GPGV、GINV，对GLRaV-3 没有特异性（图2-D～F）。因此，选择引物Ⅰ进行后续试验。

图2 引物特异性检测Fig.2 Primers specificity test for GLRaV-3

2.3 RT-LAMP 反应条件优化

2.3.1 反应时间 当反应时间超过60 min时，均能扩增出清晰明亮的梯状条带（图3-A），反应底物颜色变为绿色，在蓝光仪下出现亮光（图3-B、C）。但出于省时考虑，选取60 min反应时间进行后续试验。

2.3.2 反应温度 如图4 所示，随着温度的升高，梯状条带亮度与清晰度呈先增强后减弱的趋势，当反应温度为62.3 ℃时，开始扩增出梯状条带（图4-A），当反应温度为64.0、65.4、66.7 ℃时，反应底物均变为绿色（图4-B），在蓝光仪下均出现亮光（图4-C），在这3 个温度下RT-LAMP 扩增效率差别不大，但温度为64.0 ℃时梯状条带较为明亮清晰（图4-A）。因此，选取64.0 ℃作为后续试验的反应温度。

图4 反应温度对RT-LAMP的影响Fig.4 Effect of reaction temperature on RT-LAMP

2.3.3 Mg2+浓度 如图5所示，Mg2+浓度在2～14 mmol·L-1均能扩增出梯状条带，条带亮度呈先增强后减弱。其中Mg2+浓度为8 mmol·L-1时，梯状条带最清晰明亮，加入染色剂后所得结果与之一致。因此，反应体系中Mg2+最佳浓度为8 mmol·L-1。

图5 Mg2+浓度对RT-LAMP的影响Fig.5 Effect of Mg2+ concentration on RT-LAMP

2.3.4 Bst DNA 聚合酶 如图6 所示，Bst DNA 聚合酶浓度在0.16～0.64 U·μL-1时均能扩增出梯状条带，但随着Bst DNA 聚合酶浓度的增加，条带亮度逐渐增强（图6-A）。浓度在0.48 U·μL-1时，反应底物变为绿色（图6-B），在蓝光仪下出现亮光（图6-C），之后随浓度增加反应底物颜色和荧光亮度无明显变化。因此，选取0.48 U·μL-1作为Bst DNA 聚合酶最佳浓度。

图6 Bst DNA聚合酶浓度对RT-LAMP的影响Fig.6 Effect of Bst DNA polymerase concentration on RT-LAMP

2.3.5 甜菜碱浓度 如图7所示，甜菜碱浓度在0.2～1.4 mol·L-1时均能扩增出梯状条带，且条带亮度与清晰度随甜菜碱浓度的增加呈先增强后减弱的趋势，其中浓度为1.0 mol·L-1时，梯状条带最为清晰明亮（图7-A），反应底物变为绿色（图7-B），在蓝光仪下出现亮光（图7-C），之后随浓度增加梯状条带清晰度、反应底物颜色和荧光亮度无明显变化。因此，选取1.0 mol·L-1作为甜菜碱最佳浓度。

图7 甜菜碱浓度对RT-LAMP的影响Fig.7 Effect of betaine on RT-LAMP

2.3.6 dNTPs 浓度 如图8 所示，dNTPs 在0.4～1.6 mmol·L-1时均能扩增出梯状条带，且条带亮度与清晰度随dNTPs浓度的增加而增强（图8-A），其中浓度在1.0 mmol·L-1时，反应底物变为绿色（图8-B），在蓝光仪下出现亮光（图8-C），之后随浓度增加反应底物颜色和荧光亮度无明显变化，但浓度在1.4 mmol·L-1时梯状条带最为清晰明亮（图8-A）。因此，选取1.4 mmol·L-1作为dNTPs最佳浓度。

图8 dNTPs浓度对RT-LAMP的影响Fig.8 Effect of dNTPs concentration on RT-LAMP

2.4 RT-LAMP和RT-PCR灵敏度比较

灵敏度测验结果显示，随着RNA浓度的降低，电泳条带逐渐变淡（图9-A、B），经SYBR Green Ι荧光染液染色，反应底物颜色由绿色逐渐变为橙红色（图9-C），在蓝光仪下的荧光亮度也逐渐降低（图9-D）。RT-PCR能够检测出GLRaV-3 的最低RNA 浓度为100 pg·μL-1（图9-A），RT-LAMP能够检测出GLRaV-3的最低RNA浓度为10 pg·μL-1（图9-B），说明本研究建立的GLRaV-3 RT-LAMP 检测法与RT-PCR 检测法相比，能够对更低浓度的RNA进行检测，其灵敏度是RT-PCR的10倍。

图9 灵敏度检测Fig.9 Sensitive detection

2.5 田间样品检测

应用RT-PCR和RT-LAMP对田间随机采集的15个卷叶样品进行检测。结果表明，RT-PCR 和RT-LAMP均检测出了13 个阳性样品（图10），检测结果一致，说明该研究建立的GLRaV-3 RT-LAMP 检测方法可用于田间葡萄样品的检测。

图10 RT-PCR 和RT-LAMP 方法检测田间样品Fig.10 Field-infected samples detected by RT-PCR and RT-LAMP

3 讨论

RT-LAMP 因具有操作简单、反应快、灵敏度高的特点，已广泛用于植物病毒的检测［23-27］。Walsh 等［14］在2013 年开发了一种GLRaV-3 单管一步逆转录环介导等温扩增检测方法，该方法直接以RNA 为模板，在LAMP 体系中加入AMV 逆转录酶，在60 ℃恒温条件下反应2 h 完成检测，并以羟基萘酚蓝（hydroxy napthol blue）作为指示剂，通过观察反应底物由蓝紫色到天蓝色的变化判断检测结果。本研究前期使用该方法对感染GLRaV-3 的样品进行了检测，未扩增出梯状条带，推测是由于AMV 逆转录酶（酶反应温度范围为42～58 ℃）和Bst DNA 聚合酶（酶反应温度范围为60 ℃～65 ℃）的反应温度相差较大，导致LAMP敏感性受到一定的影响［28］。本研究建立的GLRaV-3 RT-LAMP快速检测方法，以SYBR Green Ⅰ作为检测指示剂，在64 ℃恒温条件下反应1 h 完成检测。与Walsh 等［14］建立的方法相比，本研究以cDNA为模板的二步LAMP方法具有稳定性高的优点；本研究建立的GLRaV-3 RTLAMP检测方法的反应时间更短，仅为Walsh等所建体系反应时长的1/2；所用的指示剂SYBR GreenⅠ颜色变化是由橙红色变为绿色，与Hydroxynapthol blue指示剂相比更易区分［29］。此外，还可利用紫外灯对反应产物进行照射，根据荧光强度变化进行结果判定，进一步保证了结果的可靠性，增强了该技术的可视化程度，也更方便实际应用［30］。

本研究以GLRaV-3CP基因分离物（GenBank 登录号：KC477128.1）为靶序列，在其保守区域内设计了3 对RT-LAMP 检测引物，结果显示引物Ⅰ和Ⅲ均能够扩增出明亮清晰的梯状条带，引物ⅡRT-LAMP反应十分微弱，无清晰条带出现，推测这可能是由该引物不适应RT-LAMP 反应特点导致的。在进行特异性检测时，引物Ⅰ仅能扩增出GLRaV-3，而引物Ⅲ却扩增出其他病毒条带，对GLRaV-3 没有特异性，推测可能是该引物与靶标序列不完全互补所致。

由于RT-LAMP 检测方法扩增效率高，灵敏度比常规RT-PCR 检测方法高出一个数量级，产物量多和灵敏度高使得加入核酸染料时，容易发生气溶胶污染，产生假阳性［31-33］。张吉红等［34］建立烟草环斑病毒RT-LAMP 检测方法时，采用在反应管盖上滴加SYBR greenⅠ染料的方式，反应结束后离心，可实现不开盖的情况下直接使染料与扩增产物混合，避免反复开盖而造成的污染问题，本研究也采用该方法，大大降低了污染率。与常规RT-PCR 方法相比，本研究建立的GLRaV-3 RT-LAMP 检测体系，在保持PCR 技术优点的基础上，不需要特殊仪器和热循环，操作简单；整个过程可以在60 min 内完成，更加省时；加入SYBR GreenⅠ后，阴阳性结果颜色差别明显，易于肉眼判断；适用于基层生产部门进行田间葡萄样本和脱毒苗木的快速检测。

4 结论

本研究以GLRaV-3CP基因为靶序列设计3 对RT-LAMP 引物，通过引物筛选和体系优化，最终获得RT-LAMP 最佳反应引物为GLRaV3-LAMP-Ⅰ；最佳反应体系为：Bst DNA 聚合酶浓度为0.48 U·μL-1，Mg2+浓度为8 mmol·L-1，甜菜碱浓度为1.0 mol·L-1，dNTPs浓度为1.4 mmol·L-1；最佳反应条件为：64 ℃反应60 min。该检测体系的灵敏度为10 pg·μL-1，适合于鲜食葡萄和糖度较高的酿酒葡萄样品检测，可满足科研、基层单位对GLRaV-3的快速检测的需要。