不同成熟期鲜枣香气物质变化及相关合成酶活性研究

王丽娜 陈 川 何荣军 孙培龙

（浙江工业大学食品科学与工程学院，浙江 杭州 310000）

枣（ZiziphusjujubaMill.），又名枣子、大枣、刺枣、贯枣，英文称Chinese jujube 或Chinese date，属鼠李科（Rhamnaceae）枣属植物，含有丰富的生物活性物质，被用作传统药物［1］；同时还具有独特而诱人的香气，是广受欢迎的鲜食水果之一。其香气提取物作为食品工业中理想的天然香料成分，产量逐年增长［2］。

近年来，随着仪器分析技术的发展，水果香气成分鉴定取得了长足的进步。气相色谱-质谱联用技术（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）是水果和蔬菜风味分析中应用最广泛的技术；此外，还有离子迁移色谱（ion mobiIity spectrometry，IMS）、气相色谱-嗅闻技术（gas chromatography-olfactometry，GC-O）、电子鼻等常用仪器［3］。醛、酮、酯、酸和醇等化合物是构成不同品种枣香气的主要成分，其中己醛、（E）-2-己醛、壬醛、正癸酸、（Z）-2-庚烯醛和苯甲醛是鲜枣果实的主要挥发性成分［4-5］；同时蒸馏萃取法可萃取较多的醛类、酯类和酸类香气物质［6］。香气成分的组成和含量会随着果实成熟发生变化，金丝4 号枣在白熟期、半红期、全红期分别检测到13、38、27 种香气成分，其中酯类物质在半红期种类和含量最多［7］；骏枣香气成分数量随着成熟度增加而增加［8］。成熟过程中，内在物质的变化会导致果实品质（包括颜色、硬度以及特征香气）发生变化［9-10］。因此，研究枣成熟阶段的关键物质变化有助于更好地了解枣的香气形成规律。

果实香气的形成涉及不同生物合成途径、最终代谢物的积累及其调控［11］等方面，其中脂氧合酶（lipoxygenases，LOX）途径对许多水果的生理代谢具有重要作用［12-13］。LOX催化亚油酸或亚麻酸转化为氢过氧化物，过氧化氢裂解酶（hydroperoxidelyase，HPL）进一步将其还原为己醛和（E）-2-己烯醛［14］。随后是醛的降解，在乙醇脱氢酶（alcoholdehydrogenase，ADH）的作用下生成相应的C6 醇，通过醇酰基转移酶（alcohol acyl transferase，AAT）的催化最终生成挥发性酯［15］。Luo 等［16］发现Nanguo 梨成熟过程中LOX、ADH和AAT 活性逐渐升高。隋静等［17］比较丰香和罗莎两种草莓香气成分与AAT 活性的关系，发现果实在成熟过程中香气含量与AAT 活性密切相关，红熟期丰香果实的AAT 活性及酯类化合物含量均高于罗莎。然而关于关键酶活性对枣在成熟过程中香气成分变化的影响鲜有报道。

目前通过香气活力值（odor active values，OAV）结合鲜枣不同成熟阶段香气特征研究较少，探究不同成熟阶段鲜枣香气成分的变化，可以为优化鲜枣的采收提供依据，同时有助于鲜枣的保鲜和加工过程中的香气控制和调整。基于此，本研究以品质优良、市场价值高的中国国家地理标志产品壶瓶枣、板枣和赞皇大枣（均为干鲜兼用枣）为试验品种，以4 个不同成熟阶段的鲜枣为试验材料，探究不同成熟期香气积累与酶活性之间的关系，旨在明确成熟过程对鲜枣香气成分的影响，解析鲜枣果实香气形成机理。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜枣来自山西农业大学果树研究所国家枣种资源圃/国家园艺种质枣分库，采收于2021年8—9月份，包含3 个品种（壶瓶枣-HPZ，板枣-BZ，赞皇大枣-ZHDZ）4个成熟时期（S1-青白期，S2-半红期，S3-全红期，S4-后熟期），选取长势基本一致、生长发育良好的植株，进行随机均匀采样并混匀。鲜枣大小均匀、果形正常、无机械损伤。当日运回实验室，置于-80 ℃冰箱保存。

试验所需药品、试剂均为分析纯：C8-C20正构烷烃标准品，美国Sigma-Aldrich 公司；正己烷、6-甲基-5-庚烯-2-醇标准品（＞99%），信阳市中检计量生物科技有限公司；植物中脂肪氧合酶（LOX）活力检测试剂盒、乙醇脱氢酶（ADH）活力检测试剂盒及乙醇酰基转移酶（AAT）试剂盒，北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

DSQ II单四级杆气相色谱质谱（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）联用仪，美国Thermo 公司；DB-5（60 mm×0.25 mm，0.25 μm）石英毛细管柱，美国安捷伦公司；DVB/CAR/PDM 混合涂层纤维（50/30 μm）萃取头，美国Supelco 公司；FA1004 电子天平（量感0.1 mg），上海茂宏电子科技有限公司；HH-2 水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司；TGL-16 湘仪冷冻离心机，浙江赛德仪器设备有限公司；T6 新世纪紫外分光光度计，巩义市宏华仪器设备工贸有限公司；L18-Y915S九阳破壁机，九阳股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理 同一品种、同一成熟度的果实解冻后切片，去核，破碎后均匀混合，用于香气物质测定。取3.0 g 样品置于20 mL 顶空瓶中，密闭封口，用于挥发物萃取，每个样品平行测定3 次。固相微萃取（solid phase micro-extraction，SPME）优化后条件：萃取时间30 min，萃取温度50 ℃，解析时间3 min。

1.3.2 GC-MS测定方法 参考Wang等［4］和Chen等［5］的方法，并进行调整。

气相条件：进样口温度250 ℃；传递线温度250 ℃；升温程序：起始温度40 ℃，保持3 min，然后以10 ℃·min-1的速度升至200 ℃，保持5 min，再以10 ℃·min-1的速度升至240 ℃，保持10 min。质谱条件：质谱检测器采用电子电离（electronic ionization，EI）模式；离子源温度250 ℃；电子能量70 eV；质谱扫描范围35～500m/z。检测结果采用NIST（National Institute of Standard and Technology Standard Reference Database）数据库（2.0 版）和保留指数（retention index，RI）进行香气成分鉴定。RI的计算公式如下：

式中，t为检测化合物的保留时间；tn为在检测化合物前洗脱的烷烃标准物的保留时间，n为该标准物的碳数；tN为检测化合物后洗脱的烷烃标准物的保留时间，N为标准物的碳数。以6-甲基-5-庚烯-2-醇为内标物，对香气物质进行定量。所有样本重复运行3次。

1.3.3 香气活性值计算 按以下公式计算香气活力值：

式中，Ci为香气化合物的含量（mg·kg-1）；OTi为该化合物在水中的阈值（mg·kg-1）。

1.3.4 关键酶活性测定 关键酶LOX、ADH 及AAT活性检测采用紫外分光光度法，具体步骤均严格按照试剂盒说明书操作。

1.4 数据统计与分析

相关性分析采用SPSS 26.0 软件中双变量相关性检测，以皮尔逊（Pearson）相关系数评估变量间的线性关系，采用双尾检验。差异性采用邓肯式多重差异分析（P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著），结果以平均值±标准差表示，并采用OriginPro 2021 软件绘图。

2 结果与分析

2.1 鲜枣成熟过程中香气物质的变化

GC-MS 检测结果见表1。3 个品种鲜枣中共检测到46 种香气物质，主要为醛类、酸类、酯类，而酮类和醇类物质含量较少。枣品种间香气成分的组成和含量有所差异，3 个鲜枣品种成熟过程中共有的香气成分是戊醛、己醛、（E）-2-己烯醛、苯甲醛、（E）-2-辛烯醛和1-戊烯-3-酮。

表1不同成熟期鲜枣香气成分及其含量（鲜质量）Table 1 Aroma components and contents of fresh jujube at different maturity stages（/mg·kg-1 FW）

HPZ、BZ 和ZHDZ 中不同香气物质种类组成和含量差异比较见图1。

图1 鲜枣果实成熟过程中各类香气物质含量的变化趋势Fig.1 Changes in contents of various classes of aroma compounds in jujube during ripening

醛类物质是鲜枣中主要香气成分［4］，不同品种的枣在S2～S4 阶段醛类物质的累积情况存在显著差异（P＜0.05）。随着成熟度的增加，HPZ 中的醛类物质含量逐渐增加，最高含量为5.35 mg·kg-1（S4）；而BZ 和ZHDZ 中的醛类物质含量分别在S2 （12.44 mg·kg-1）和S3 （13.94 mg·kg-1）时期达到峰值，并且随成熟度增加而下降。（E）-2-己烯醛在HPZ（2.20 mg·kg-1）、BZ（4.67 mg·kg-1）、ZHDZ （4.20 mg·kg-1）中含量较多，与Wang等［4］在BZ中的发现一致。

酯类化合物在成熟初期较少，S4时期含量最多。这一变化规律与赵峰等［7］的发现一致。3种鲜枣酯类香气成分总量差异明显，HPZ中的苯甲酸乙酯、癸酸乙酯和壬酸戊酯是后熟阶段（S4）新增香气物质。月桂酸甲酯（1.01 mg·kg-1）和S4阶段新增的癸酸乙酯（0.99 mg·kg-1）为ZHDZ 中含量较多的酯类。BZ 的S2～S4时期均发现癸酸乙酯（0.13～0.17 mg·kg-1）和月桂酸乙酯（0.053～0.063 mg·kg-1），其中癸酸乙酯含量最多。

酮类物质在HPZ的S4 （0.28 mg·kg-1）时期达到最大值；在BZ和ZHDZ中均随成熟度增加呈现先上升后下降趋势，分别在S2 （0.61 mg·kg-1）和S3 （0.67 mg·kg-1）时期达到最大值。1-戊烯-3-酮是主要酮类物质；2-壬酮是HPZ和BZ在S4时期新增香气物质。

ZHDZ 与HPZ、BZ 在不同成熟阶段酸类香气成分差别较大。HPZ中酸类物质含量在成熟过程中逐渐下降，S1 时期最高（2.41 mg·kg-1）；其主要成分为乙酸、己酸和月桂酸。BZ 和ZHDZ 中含量最多的酸类物质为癸酸，这与Chen 等［5］的结果一致，其最高含量分别为1.76 mg·kg-1（S2）和1.49 mg·kg-1（S3）。BZ在S2时期开始检测到酸类物质（4.64 mg·kg-1）并在成熟后期有所下降，而ZHDZ在S3 （3.57 mg·kg-1）时期酸类物质达到最大值。但S1 时期酸类物质占总香气成分的百分比最大。

2.2 鲜枣香气活性物质

香气活性值（OAV）［23］可以分析比较不同香气成分在食品中的贡献度。通常挥发性化合物的OAV值＞1被定为香气活性物质［24］。根据阈值计算，鲜枣中OAV＞1的物质有23 种，香气活性物质主要为醛类、酯类和酮类物质。

根据表2，在HPZ、BZ 和ZHDZ 中分别鉴定到21、18和19种关键香气成分，其中共有的香气活性物质为己醛、（E）-2-己烯醛、（E）-2-辛烯醛、1-戊烯-3-酮和月桂酸。香气活性值较高的成分己醛（OAV167-280）、（E）-2-己烯醛（OAV83-118）、（E）-2-辛烯醛（OAV11-28）、（Z）-2-庚烯醛（OAV321-1327）、1-戊烯-3-酮（OAV29-122）和月桂酸（OAV38-162）对HPZ整体香气贡献较大。己醛（OAV154-255）、（E）-2-己烯醛（OAV123-275）、（E）-2-辛烯醛（OAV19-392）、（E）-2-壬烯醛（OAV504）、1-戊烯-3-酮（OAV45-306）和月桂酸（OAV67-618）对BZ 整体香气贡献较大。己醛（OAV151-265）、（E）-2-己烯醛（OAV122-247）、（Z）-2-庚烯醛（OAV26-82）、（E）-2-辛烯醛（OAV26-33）、（E）-2-壬烯醛（OAV484-7149）、1-戊烯-3-酮（OAV56-408）、月桂酸（OAV72-144）和月桂酸甲酯（OAV87-383）为ZHDZ中贡献较大的香气活性物质。

表2 不同成熟期各鲜枣香气活性值Table 2 Aroma activity value of fresh jujube at different maturity stages/（mg·kg-1）

香气活性值可以作为评价该香气成分对样品贡献度的标准指标。在所有枣中醛类物质香气值最大，这与在柠檬［25］和蔓越莓［26］中的发现相似。BZ 中己醛香气活性值在成熟过程逐渐降低，在成熟初期香气活性值最大，这与其他品种变化相反。呈清新、黄瓜味的（E）-2-壬烯醛仅在BZ 的S2 时期有贡献，在ZHDZ 的S3 时期贡献最大。醛类中的癸醛仅在ZHDZ 的S4 时期有贡献。酯类中关键香气成分主要为月桂酸甲酯，也集中在成熟后期。

2.3 鲜枣成熟过程中关键酶活性变化

目前从枣中检测到的醛类和酯类物质的合成主要与LOX途径有关［27-28］。LOX、ADH和AAT是LOX途径的3 个关键酶，是大多数植物形成香气物质的主要途径之一［29］。由图2可知，鲜枣成熟过程中酶活性变化也不同，LOX、ADH和AAT最高值出现的时间有差异。

图2 鲜枣果实成熟过程中酶活性变化趋势Fig.2 Changes trend of enzyme activity during jujube fruit ripening

根据试验结果所示，LOX 途径3 个关键酶在不同成熟期的活性均存在较明显的差异。3 种鲜枣果实在成熟过程中的LOX活性均高于ADH和AAT。LOX酶催化产物为后续短链醛、醇和酯的形成提供原料［30］。HPZ和ZHDZ 的酶活性变化趋势相似，其LOX 活性均在S3时期达到最大值，分别为1 168.37 和1 834.43 U·g-1；AAT 活性也同样在该时期达到最大值；ADH 活性变化趋势有所不同，ADH 活性在HPZ 成熟过程中不断增加，在S4 达到最大，而ZHDZ 则在S2 下降至最低值后迅速增加，在S3 时期达到最大值（0.79 U·g-1）。BZ 的LOX 活性在S2 时期达到最大值，为1 462.38 U·g-1，随后开始迅速下降；ADH 活性随着果实成熟呈现整体逐渐下降趋势，最低值为0.08 U·g-1，和其余2 种鲜枣果实变化相反；AAT 活性从S1～S2时期迅速增加，而后变化缓慢，到S4时期有所下降。

2.4 LOX途径关键酶与香气物质之间的相关性

对3种枣各个成熟阶段LOX 关键酶和主要香气物质以及关键呈香物质己醛进行相关性分析，结果如图3 所示。不同品种果实的关键酶与香气物质之间相关性存在差异。LOX与醛类相关性分析中，仅BZ中醛类物质与LOX 活性有显著相关性（r=0.764，P＜0.05）。在对LOX活性与己醛相关性分析中发现，己醛在BZ（r=0.748）和ZHDZ（0.690）中与其呈现显著相关性（P＜0.05），这与张曾等［30］对猕猴桃的研究结果一致。ZHDZ 的酮类物质与LOX、ADH 和AAT 活性均有相关性。除ZHDZ的AAT活性与醛类物质呈极显著相关（r=0.980）外，其余品种ADH和AAT活性与醛类物质无明显相关性。HPZ 中ADH 活性与酯类物质相关性最强（r=0.914）。在ZHDZ 中，AAT 活性与醛、酮和醇类有显著相关性，与酯类物质无相关性；相反的是，HPZ 和BZ的AAT活性与酯类物质有显著相关性。

图3 不同成熟期鲜枣果实LOX途径与香气物质相关热力图Fig.3 The LOX pathway of fresh jujube fruit at different maturity stages and the heat map related to aroma substances

3 讨论

香气是水果品质的重要指标之一，影响关键香气成分的主要因素是果实的成熟度。随着果实的生长，香气化合物的种类和含量会发生变化［29］。以芒果为例，在成熟初期酸类和萜类香气化合物含量最多，而随着果实成熟酯类化合物含量逐渐增加［31］；杏果实在发育过程中醛类和萜类含量显著减少，而酯类含量则随着果实成熟急剧增加［32］。本研究同样发现，在鲜枣成熟过程中，酯类化合物的含量逐渐上升。王淑贞等［33］对不同成熟期鲁北冬枣的研究发现，酯类是青白期和半红期主要挥发性物质，全红期中含量仍然最多但总体含量开始下降，这与本研究中3 种鲜枣的酯类含量变化不同。鲜枣品种间基因差异也会影响酯类含量变化，可能的原因是，果实底物的可利用性随成熟度而增加，导致酯类化合物积累，并且与AAT 活性相关［31］。许多研究表明，醛类物质是最丰富的香气成分［4，5，33］。本研究中，BZ醛类化合物在半红期（S2阶段）积累达到最高峰，随后逐渐下降；而HPZ 和ZHDZ 醛类化合物的含量则在后熟期（S4 阶段）达到最高。该趋势与Song等［8］的研究结果基本一致。C6 醛是未成熟果实香气的主要贡献者［34］，随着果实成熟，苹果［34］、草莓［35］、鳄梨［36］中的C6醛含量逐渐下降。与之相反，本研究发现在鲜枣成熟期内，己醛和（E）-2-己烯醛的含量显著增加，与Song 等［8］的研究结果一致，即：（E）-2-己烯醛的含量在新疆骏枣不同成熟阶段显著增加（20.88%～36.70%），但除GM 阶段外，其余3 个成熟期的己醛含量变化并不显著，这可能也与枣的品种和产地环境因素有关。此外，在BZ 的半红期（S2），C6 醛物质种类较另外两种更为多样，因此，不同品种的鲜枣在果实成熟过程中的醛类化合物变化趋势可能受到其自身代谢合成差异的影响［37］。

除成熟度外，香气活性值和特有香气活性物质也是香气的重要影响因素。本研究香气活性值分析中，共有23 种香气化合物OAV 值在枣果实中大于1。其中，己醛（青草味）和（E）-2-己烯醛是3 个品种鲜枣中共有的特征香气成分，并且己醛、（E）-2-己烯醛、（Z）-2-庚烯醛、（E）-2-壬烯醛、（E）-2-辛烯醛、1-戊烯-3-酮和月桂酸是鲜枣中的特征香气成分，而Zhu等［38］对干枣OAV 值研究发现，己醛（OAV：39～85）和（E）-2-辛烯醛（OAV：32～70）是干枣中最主要的两种风味物质，这也证明醛类物质对枣香气的贡献度较大。然而，不同品种的鲜枣OAV 值在不同成熟阶段有所不同。在HPZ 和ZHDZ 的S4 时期，己醛和（Z）-2-庚烯醛分别达到最大香气值，而BZ 则在S2 时期达到最大，这与香气成分成熟期变化规律相符。月桂酸和1-戊烯-3-酮含量在3 种果实成熟过程中逐渐降低，（E）-2-己烯醛含量在HPZ 和ZHDZ 成熟过程逐渐增加，在S4 时期香气值达到最大，而BZ 则在S2 时期达到最大，随后在成熟过程中下降；（E）-2-辛烯醛在3 种果实的S2 时期达到最大，随后逐渐下降；而（Z）-2-庚烯醛香气值变化在3种果实中均不同，最大香气值出现时期也不同。

酶活性也是决定香气的重要因素之一，LOX、ADH和AAT 是LOX 途径中香气物质形成的3 种关键酶［12］。本研究结果表明，在4个成熟阶段中，LOX 活性均高于ADH和AAT活性。此外，不同品种之间LOX活性也具有显著差异，其中ZHDZ品种的LOX活性最高。3种果实的ADH 活性变化趋势不同，HPZ 和BZ 的变化趋势相反。在成熟过程中3种鲜枣果实AAT活性变化趋势相同，均在S3 阶段达到最大值。在LOX 途径中，ADH活性在成熟过程中的变化趋势与醇类物质含量变化趋势相反，可能是由于反应过程中底物醛含量不足，该结果与金橘不同成熟期ADH 活性的变化趋势相似［39］，这是ADH 在部分水果成熟过程中的变化特点。当BZ 和ZHDZ 进入LOX 活性达到最大时期时，会增加己醛、（E）-2-己烯醛、（E，E）-2，4-戊烯醛和（E）-2-辛烯醛等醛类物质的含量。然而，HPZ 醛类物质含量的快速增加则发生在S4 时期。这一结果表明醛类物质的生成不仅与酶活性有关，还与LOX 底物含量及其专一性相关［40-42］。并且不同品种间的编码基因表达可能会导致相关性的差异［43］，因此有必要进一步研究果实成熟过程中香气成分变化与脂肪酸途径相关基因表达的关系。综上所述，LOX 在决定果实中直链挥发性化合物的形成中起着重要作用；而ADH 活性与醇类物质含量呈现负相关，这可能是由过量产物对酶活性的反馈抑制所致［39，44］。

4 结论

本研究对不同品种鲜枣果实成熟过程中的挥发性化合物和代谢途径关键酶进行分析，结果发现醛类物质在3 种果实香气成分中含量最高。随着成熟度的增加，己醛、（E）-2-己烯醛、苯甲醛、癸酸等香气物质含量增加。月桂酸、1-戊烯-3-酮、（E）-2-己烯醛、（Z）-2-庚烯醛和（E）-2-辛烯醛是影响不同成熟期特征香气的主要物质。同时发现LOX 途径关键酶活性对香气成分的影响在品种之间存在差异，BZ 和ZHDZ 中LOX活性与醛类物质含量呈正相关，HPZ和BZ中AAT活性与酯类物质含量呈正相关，ADH 活性仅在HPZ 中与酯类物质含量呈显著正相关。