泰乐菌素发酵补料工艺优化研究

陈东，郭佳，王婷，白海龙，哈丽媛

(宁夏泰益欣生物科技股份有限公司，宁夏 银川 750205)

0 引言

泰乐菌素(Tylosin)，又称泰乐星、泰乐霉素，一种禽畜专用的由弗氏链霉菌产生的十六元大环内酯类抗生素[1-2]。泰乐菌素不仅是我国畜禽养殖业防治支原体疾病的理想药剂，而且是一种优良的饲料添加剂，除疾病预防外，对禽、畜生长也有良好的促进作用。

在菌种发酵过程中，补料量、pH值、溶解氧浓度、温度、底物浓度、产物浓度等对微生物的生长起重要作用[3-4]。泰乐菌素在发酵后期由于菌体易老化和自溶，导致生产能力下降，严重影响泰乐菌素产量[5]。当前，国内泰乐菌素生产工艺普遍采用分批补料的方式，通过控制和优化补料量等参数的变化，使发酵效价达到最大[6]。然而，现有工业生产中对泰乐菌素发酵补料时间及补料次数的研究鲜有报道。因此，本研究以泰乐菌素分批补料发酵工艺为基础，对泰乐菌素发酵补料工艺进行优化研究，探讨泰乐菌素发酵的最佳补料时间和补料次数。

1 仪器与试剂

1.1 试剂

豆油、硫酸铵；综合补料培养基成分组成：玉米淀粉为0.5%、(NH4)2HPO4为 0.2%、麸质粉为1.0%、CaCO3为0.8%、棉籽饼粉为1.5%、硫酸镍为0.2%、NaCl为0.5%、KCl为0.1%、CoCl2为 0.8%、纯化水(其余)。

1.2 仪器

实验仪器如表1所示。

表1 实验仪器

2 材料与方法

2.1 实验材料

泰乐菌素菌种由宁夏泰益欣生物科技股份有限公司提供。

2.2 实验方法

泰乐菌素效价采用高效液相色谱法(HPLC)检测：发酵液残糖采用菲林试剂法检测；采用甲醛氧化法检测发酵液中氨基氮含量。

2.3 数据处理

所得试验数据均采用Microsoft Excel 2010进行数据处理分析。

3 结果与分析

3.1 补油对泰乐菌素效价的影响

豆油含有丰富的油酸和亚油酸，二者经过甲基化生成甲基油酸，其作为泰乐菌素的前体物质，能促进泰乐菌素的生物合成，因此工业生产中常以豆油作为泰乐菌素发酵的主要碳源[7]。相关研究证明，豆油浓度影响泰乐菌素的产量，其含量过低，不利于泰乐菌素菌丝生长，而含量过高不易充分利用，造成脂肪酸过量，降低发酵液pH值，影响菌种产素能力，降低泰乐菌素产量[8]。因此，泰乐菌素菌种发酵过程中，严格控制豆油的加量对其发酵起至关重要的作用。

接种8 h后，每隔4 h检测发酵液pH值，当pH值小于6.6时，以0.2%进料量补加豆油，维持泰乐菌素发酵液pH值处于7.0～7.2之间。接种48 h后，每隔24 h进行泰乐菌素发酵液效价测定，观察补加豆油后泰乐菌素发酵液效价变化趋势。图1结果表明：补加豆油后泰乐菌素发酵液效价增速显著提高，在发酵后期高达14 100 μg/mL，较无补油增高了19.90%。原因可能是及时补加豆油不仅为泰乐菌素发酵提供碳源，而且其脂肪酸分解后通过调节发酵液的pH值，使之处于菌体产素的最佳范围，从而提升了泰乐菌素发酵效价。

图1 补油对泰乐菌素效价的影响

3.2 补加硫酸铵对泰乐菌素效价的影响

接种8 h后，每4 h检测1次氨基氮含量，根据氨基氮含量补加硫酸铵，流速为0.15%/d，接种48 h后，每隔24 h进行泰乐菌素发酵液效价测定，观察补加硫酸铵后泰乐菌素发酵液效价变化情况。泰乐菌素氨基氮检测结果如图2所示，泰乐菌素发酵效价变化情况如图3所示。

图2 泰乐菌素氨基氮检测结果

图3 补加硫酸铵对泰乐菌素效价的影响

根据发酵液中的氨基氮含量优化补料工艺，以期提升泰乐菌素发酵效价。补加硫酸铵使氨基氮水平维持在50～90 mg/mL之间。由图3可知，随着发酵周期的延长，补加硫酸铵后泰乐菌素发酵效价增速明显提升，且在发酵后期高达13 900 μg/mL，较无补料效价提高了25.68%。

3.3 单次补料时间对泰乐菌素发酵效价的影响

基于豆油和硫酸铵的补料发酵情况及发酵液中的残糖含量进行单次补料实验，分别于发酵48、72、96、120、144 h后进行单次补料，研究单次补料时间对泰乐菌素发酵效价的影响。泰乐菌素残糖浓度检测结果如图4所示，泰乐菌素效价变化情况如图5所示。

图4 泰乐菌素残糖浓度检测结果

图5 单次补料对泰乐菌素发酵效价的影响

由图4可知，补料使泰乐菌素残糖浓度维持在0.50～2.00 g/100 mL之间。由图5可知：单次补料发酵效价显著高于无补料发酵效价，其中在48 h补料时效果最佳，发酵液效价增速稳定，发酵后期效价高达13 987 μg/mL，显著高于其他补料批次；96 h补料次之，其发酵效价增速相对稳定，但效价低于48 h补料发酵效价；72 h补料对泰乐菌素发酵效价增速促进不大，在发酵后期，增速减弱；120 h和144 h补料对泰乐菌素发酵效价促进作用较小，最终发酵效价显著低于其他实验批次。

3.4 两次补料对泰乐菌素发酵效价的影响

在单次补料实验基础上，尝试在发酵48 h补料后分别在72 h、96 h、120 h、144 h 进行第2次补料，每隔24 h测定发酵液效价，研究两次补料对泰乐菌素发酵效价的影响，如图6所示。

图6 2次补料对泰乐菌素发酵效价的影响

由图6可知，两次补料显著提升了泰乐菌素发酵效价，尤其在发酵96 h进行第2次补料时，其发酵效价显著高于其他实验批次，达到14 500 μg/mL，效价增速稳定；其次是发酵72 h进行第2次补料，最终效价为13 100 μg/mL，较96 h补料发酵效价降低了10.69%；120 h进行第2次补料后泰乐菌素发酵效价增速缓慢；144 h 进行第2次补料最终发酵效价显著低于其他实验批次发酵效价。

4 讨论

无补料发酵工艺因发酵前期发酵液营养丰富，菌体快速生长，后期缺乏菌体必需营养素而造成早衰，影响菌体产素能力。相关研究证明，菌种发酵过程中，优化补料量不仅能降低能源消耗与经济成本，更能提高菌种发酵效率[9-10]。因此，基于豆油和硫酸铵的补料发酵情况及发酵液中的残糖含量和氨基氮含量优化泰乐菌素补料工艺，通过对补料次数和补料时间进行研究发现，两次补料发酵效价提升效率更高，其最终效价较单次补料发酵效价提高了3.67%，且最优补料时间分别是在发酵48 h和96 h，发酵效价从13 987 μg/mL提高至14 500 μg/mL。原因可能是发酵初期，泰乐菌素新生菌丝较多，但在中后期，尤其是在后期菌体出现自溶，菌丝减少进而影响菌体产素能力，而后期补料能及时提供菌体所需营养，延缓菌体早衰、促进新生菌丝的形成，从而提升泰乐菌素的发酵效价。基于本研究，推测多次补料可为泰乐菌素菌种提供更均衡的营养物质，提高菌种产素能力，对发酵效能及产量提升效率更高，拟在下一步实验中进行泰乐菌素多次补料研究，以期获得更高的发酵效价，提高泰乐菌素产量。