三氟氯氰菊酯对鸡胚的发育毒性及雏鸡生长发育的评价

姜锦鹏, 陈佳瑞, 许 昊, 储名凤, 卜祥荣, 沈 阳

(1.安徽科技学院 动物科学学院,安徽 凤阳 233100;2.动物营养调控与健康安徽省重点实验室,安徽 凤阳 233100)

三氟氯氰菊酯(Lambda-cyhalothrin,LCT),又称高效氯氟氰菊酯,是新一代Ⅱ型广谱高效拟除虫菊酯类杀虫剂。LCT具有杀虫谱广、生物活性高、药效迅速等特点,因而被广泛使用于农业和林业害虫的防治[1-2]。LCT虽被认为是高效低毒的杀虫药,但LCT具有利用率较低、吸附性强、抗药性和蓄积性较高等特点,长期过量施用容易大量残留在作物[1-2]、水体[3]、土壤[4]等环境中,可通过食物链进入动物甚至人体内,给人类与动物的健康安全带来潜在危害[5-6]。研究表明,LCT对水生生物、家蚕和蜜蜂具有较高的毒性,可产生神经、发育及生殖毒性以及癌变、致畸、内分泌干扰等多方面的毒理学效应[7-9],但一般认为LCT对成年鸟类的毒性较低。而史梦竹等[5]发现LCT对鹌鹑的经口毒性LD50为54.476 2 mg/kg,属中毒,因此LCT残留对禽类的毒性,特别是鸡胚、幼禽的发育毒性,亦不容忽视。目前尚未见LCT对鸟类胚胎发育毒性及其早期生长影响等方面的有关研究。因此,本试验拟通过鸡胚蛋注射LCT测定死胎数、生存率以及孵化率、弱雏率、出壳质量与第18天胚蛋质量的比值等指标,研究LCT对鸡胚的发育毒性,并测定出壳后21 d雏鸡的体质量、部分内脏器官指数、血清生化指标以及肝肾氧化应激指标的变化,研究LCT蓄积对鸡早期生长的毒性效应,旨在为评估LCT的残留风险、保护鸟类安全性提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 药品与试剂 三氟氯氰菊酯购自广西壮族自治区田园生化股份有限公司;丙氨酸氨基转移酶(Alanine Aminotransferase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate Aminotransferase,AST)、肌酐(Creatinine,CREA)、尿素氮(Urea Nitrogen,UREA-N)、总蛋白、总超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、还原型谷胱甘肽(Reduced Glutathione,GSH)和丙二醛(Malonaldehyde,MDA)测定试剂盒均购自南京建成生物有限公司。

1.1.2 试验动物 试验用受精草鸡蛋来自安徽科技学院实验动物中心。

1.1.3 主要仪器 FT-2-12Q型孵化机(江西方通实业有限公司孵化机械厂);SW-CJ-1F型超净工作台(苏州净化设备有限公司);LDZM-60KCS型灭菌锅(上海申安医疗机械厂);DRP-9162型电热恒温培养箱箱(上海森信实验仪器有限公司);1510型酶标仪(赛默飞世尔科技公司);L500型台式离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司);Vortex-2型旋涡混匀仪(上海沪析实业有限公司);FA2004N型电子天平(上海菁海仪器有限公司);OSE-Y50型高速组织研磨器(天根生化科技有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 孵化管理 入孵前种蛋挑选、消毒、分组、称重、编号。入孵时,各组胚蛋随机放置于孵化器各层孵化盘中,蛋钝端朝上。1～18 d孵化温度为37.8 ℃,相对湿度为56%～58%,2 h翻蛋1次;19～21 d出雏温度为37.2 ℃,相对湿度为70%。

1.2.2 胚蛋染毒 选择已孵化7胚龄、质量相近的草鸡胚蛋160枚,随机分为5组,每组32枚。Ⅰ组(对照组)向每枚鸡胚的卵黄囊注射0.1 mL生理盐水,Ⅱ～Ⅴ组(处理组)分别向每枚鸡胚的卵黄囊注射0.1 mL 2.5、25、250、2 500 μg/mL LCT,注射后及时用灭菌石蜡封空,继续孵化至雏鸡出壳。卵黄囊注射参照唐玮琦等[10]方法进行。

1.2.3 雏鸡饲养管理 试验前清扫鸡舍,清洗消毒鸡笼、食槽和饮水器。将Ⅰ～Ⅳ组(因为Ⅴ组仅出壳1只弱雏,且不久死亡,故不设Ⅴ组)出壳后雏鸡饲养于单层平置式鸡笼内,自由采食和饮水。室温、相对湿度和光照等条件按照鸡常规饲养程序操作。试验期间观察鸡的饮水、采食及精神状态,保持鸡舍卫生。

1.3 测定项目及分析方法

1.3.1 鸡胚发育指标 分别于孵化第10天和第18天进行照蛋,检测死胚数,计算死胚率,同时测定孵化第18天的胚蛋质量。出壳时,统计出雏数、弱雏数,并测量出壳质量,计算孵化率、弱雏率、出壳质量与第18天胚蛋质量的比值等。

1.3.2 雏鸡体质量和内脏器官指数 雏鸡饲养至21日龄,称量空腹(前1天晚上开始断料)时的体质量,颈部放血处死并采集血样。取血后雏鸡按常规方法宰杀,分离胸肌、腿肌、心脏、肝脏和肾脏,称量后肝、肾组织立即置于液氮冷冻,再置于-80 ℃保存备用。计算心脏指数、肝脏指数和肾脏指数。

1.3.3 血清生化指标 将上述血样于4 ℃静置4 h后,3 000 r/min离心10 min,收集血清于-20 ℃保存。每组取6个血清样品,按照试剂盒说明书测定ALT、AST活性以及CREA和UREA-N含量。

1.3.4 肝肾抗氧化指标 取肝脏、肾脏组织样品约100 mg,准确称重,加入900 mL 0.9% NaCl溶液,冰浴条件下充分研磨,匀浆液以2 500 r/min离心10 min,吸取上清液按试剂盒说明书测定总蛋白(考马斯亮蓝法)、GSH(微板法)、MDA(TBARS法)的含量和SOD活性(WST-1法),并以样品蛋白浓度校正各组的GSH、MDA含量和SOD活性。

1.4 统计分析

使用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析,最小显著性差异法进行多重比较,以“平均值±标准误差”表示,P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 三氟氯氰菊酯对鸡胚发育的影响

由表1～2可知,Ⅱ～Ⅳ组鸡胚的死胚率、孵化率、弱雏率及出壳质量与第18天胚蛋质量的比值,与对照组(Ⅰ组)相比无明显差异,但Ⅴ组的死胚数、死胚率、弱雏率明显高于对照组和Ⅱ～Ⅳ组,其出雏数、孵化率显著低于对照组和Ⅱ～Ⅳ组,特别是染毒3 d(孵化第10天)时,死胚数与死胚率明显高于对照组和Ⅱ～Ⅳ组。

表1 三氟氯氰菊酯对鸡胚死胚率、孵化率和弱雏率的影响

2.2 三氟氯氰菊酯对21日龄雏鸡生长发育的影响

由表3可以看出,胚蛋注射LCT明显抑制雏鸡的生长发育,与对照组(Ⅰ组)相比,Ⅱ～Ⅳ组雏鸡21日龄的体质量分别降低了36.30%(P<0.01)、21.02%(P<0.01)和12.73%(P<0.05),胸肌质量分别降低了18.16%(P>0.05)、36.46%(P<0.05)和34.70%(P<0.05),腿肌质量分别降低了29.31%(P<0.05)、21.10%(P>0.05)和35.10%(P<0.05),心脏指数分别降低了16.89%(P<0.05)、12.26%(P<0.05)和5.05%(P>0.05),而各组的肝脏指数和肾脏指数无明显变化。

表2 三氟氯氰菊酯对鸡胚出壳质量的影响

表3 三氟氯氰菊酯对21日龄雏鸡体质量及部分内脏器官指数的影响

2.3 三氟氯氰菊酯对21日龄雏鸡血清生化指标的影响

由表4可见,21日龄时,Ⅱ～Ⅳ组雏鸡血清CREA与UREA-N含量、AST和ALT活性,与对照组相比无显著变化。

表4 三氟氯氰菊酯对21日龄雏鸡血清生化指标的影响

2.4 三氟氯氰菊酯对21日龄雏鸡肝肾组织脂质过氧化的影响

如表5所示,21日龄时,Ⅲ组肝组织和Ⅱ组肾组织的GSH含量明显升高,与对照组相比差异显著(P<0.01或P<0.05);胚蛋注射LCT对雏鸡肝肾组织MDA含量有增加的趋势,其中Ⅲ组肝组织的MDA含量显著增加(P<0.05);各试验组肝肾组织的SOD活性有增加趋势,但与对照组相比无显著变化(P>0.05)。

表5 三氟氯氰菊酯对21日龄雏鸡肝肾组织GSH、MDA含量和SOD活性的影响

3 结论与讨论

一般认为,拟除虫菊酯类农药对水生生物毒性大,而对哺乳动物和鸟类的毒性较低。但相关研究表明,长期暴露于拟除虫菊酯环境中能干扰哺乳动物和鸟类的正常功能[5,11],特别是孕妇、孕畜、胚蛋、婴幼儿、幼畜、幼禽等特殊群体对农药等有害物质的抵抗力和易感性较低,可致其发生严重的发育障碍[12-13]。罗荪琳等[9]研究发现,高剂量(2 500 μg/mL)LCT暴露可引起受精后48 h斑马鱼仔鱼心包水肿和卵黄囊水肿,表明高剂量LCT对斑马鱼胚胎发育有毒性作用。张弯弯等[14]结果表明,随着LCT处理浓度增加和暴露时间延长,黄河鲤胚胎各个发育期的孵化率降低,而畸形率则呈渐增趋势。鸡胚12胚龄前主要营养物质来自卵黄囊,因此注射到卵黄囊内的外源物质也能够被胚胎较好地吸收,而且卵黄囊远离胚胎,注射后的应激反应较小[10]。Ohta等[15]研究表明,在孵化的第7 天注射外源性物质到卵黄囊中对鸡胚的孵化率影响较小。本试验依据鸡胚发育特性及前人研究结果,选择7胚龄时卵黄囊注射LCT对鸡胚进行染毒,结果表明,中低剂量(2.5～250 μg/mL)LCT处理对鸡胚的死亡率、出雏率和弱雏率无显著影响,但高剂量(2 500 μg/mL)LCT处理显著增加了鸡胚的死亡率和弱雏率,尤其对发育早期(孵化第10天)的鸡胚影响更大,显示高剂量LCT暴露对鸡胚发育有明显毒性作用。

LCT对哺乳动物和鸟类不仅具有急性毒性作用[5],还包括体质量减轻等诸多慢性危害。李玖营[16]研究表明,LCT蓄积毒性处理组小鼠的体质量显著低于对照组(P<0.01)。秦珩等[17]研究发现,吸入高剂量(18.98 mg/m3)氟氯氰菊酯可使雄性大鼠体质量及饲料转化率降低。本试验表明,胚蛋注射一定剂量(2.5～250 μg/mL)LCT显著降低出壳后21 d雏鸡的体质量、胸肌和腿肌质量,说明LCT还能抑制出壳后雏鸡的生长发育。

拟除虫菊酯类农药具有高度的脂溶性,能分布于肝脏、肾脏等组织,对肝脏、肾脏产生潜在的毒性作用[18]。李玖营[16]在试验中观察到LCT蓄积毒性处理组小鼠的肝肾切片局灶性坏死程度严重。秦珩等[17]研究发现,吸入中高质量浓度(9.05～18.98 mg/m3)氟氯氰菊酯可使雄性大鼠肾脏质量降低,血液AST活性升高。张颖[18]在评价拟除虫菊酯类农药潜在毒性试验中,发现联苯菊酯的暴露并未引起小鼠肝脏质量与严重的形态学变化,血清ALT和AST活性亦未出现明显的改变,但可引起肝细胞氧化损伤及凋亡,从而导致肝脏损伤。本试验中,胚蛋注射2.5～250 μg/mL LCT对出壳后21 d雏鸡的肝脏指数、肾脏指数、血清AST和ALT活性、CREA与UREA-N含量均无明显影响,这与张颖[18]的试验结果基本一致,这可能由于检测时间距染毒时间较长,血清AST、ALT活性以及CREA、UREA-N含量等常用的生化指标可能已经改善,或者血清AST、ALT活性以及CREA、UREA-N含量等常用的生化指标并非评价LCT引起的肝肾毒性的最佳指标,其影响机制尚需进一步研究。

综上,高剂量LCT暴露对鸡胚具有明显的发育毒性,胚胎期中低剂量LCT暴露抑制出壳后雏鸡的早期生长发育,氧化应激损伤是其毒性机制之一。