基于高效液相色谱指纹图谱及多模式化学计量学分析评价菝葜饮片的质量

陈彦洁，蒋学青，罗鑫，蒋佳丽，王艺洁，谢谭芳，王志萍*（1.广西中医药大学药学院，南宁 530200；2.广西高校中药制剂共性技术研发重点实验室，南宁 530200）

菝葜为百合科植物菝葜SmilaxchinaL.的干燥根茎，具有利湿去浊、祛风除痹、解毒散瘀的功效[1]。现在研究表明，菝葜中主要含有甾体皂苷类、黄酮类、氨基酸类、甾醇类和有机酸类等化合物[2]，具有抗癌、抗炎、抗氧化、降血脂[3]等多种药理作用，临床上可用于治疗肿瘤、慢性盆腔炎、乳腺增生、卵巢囊肿等[4-5]疾病。

中药组成复杂，用单一的指标难以分析评价其综合质量，中药指纹图谱技术是评价中药整体性、稳定性的一种有效方法，从整体上体现中药的化学特征，符合中医理论中全面性、整体性的特点，已成为控制天然药物整体质量的有效手段[6]。

多模式化学计量学分析主要包括聚类分析、主成分分析、正交偏最小二乘-判别分析（OPLSDA）等，能从整体上对药材进行评价[7]。指纹图谱技术结合多模式化学计量学分析能反映出中药材质量与化学组成的真实情况[8]，基于此，本研究收集了18批不同来源的菝葜饮片，建立了菝葜饮片的HPLC指纹图谱，并结合聚类分析、主成分分析及OPLS-DA，综合评价菝葜饮片的质量，以期为菝葜的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-2030 Plus型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；XSR205DU/A型电子天平（美国Mettler Toledo公司）；KQ-800DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；UPH-IV20TN型优普超纯水机（四川优普超纯科技有限公司）。

1.2 试药

绿原酸（批号：MUST-22111711，纯度：99.82%）、落新妇苷（批号：MUST-22032404，纯度：98.14%）、白藜芦醇（批号：MUST-21112413，纯度：99.82%）、黄杞苷（批号：MUST-22011202，纯度：98.10%）、槲皮苷（批号：MUST-20121401，纯度：98.87%）（成都麦德生科技有限公司）；色谱纯乙腈、甲醇（美国Fisher公司）；色谱纯磷酸[阿拉丁试剂（上海）有限公司]；其余试剂均为分析纯（成都市科隆化学品有限公司）。本研究收集了包括安徽、江西、贵州、广西、广东及湖南等地的18批菝葜饮片，饮片均由广西中医药大学田慧教授鉴定为百合科植物菝葜SmilaxchinaL.的干燥根茎，样品信息详见表1。

表1 菝葜饮片来源信息Tab 1 Sample information of Smilax china L.

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 供试品溶液的制备 取菝葜饮片粉末（过2号筛）约0.5 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，加入70%甲醇25 mL，超声（320 W，40 kHz）45 min，放冷，补足质量，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液即得。

2.1.2 混合对照品溶液的制备 取落新妇苷、黄杞苷、白藜芦醇、绿原酸及槲皮苷对照品适量，精密称定，加70%甲醇溶解并定容至刻度，制成质量浓度分别为 0.420、0.190、0.260、0.666、0.206 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2 HPLC指纹图谱的建立与分析

2.2.1 色谱条件 Shim-pack GIST C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～25 min，9%A；25～110 min，9%～29%A；110～115 min，29%～9%A；115～120 min，9%A）；流速：1 mL·min-1；柱温：35℃；检测波长：302 nm；进样量：10 μL。

2.2.2 精密度试验 取菝葜饮片（YP1）0.5 g，按“2.1.1”项下条件制备，再按“2.2.1”项下色谱条件连续进样分析6次，以5号峰（落新妇苷）为参照峰S，计算得到各共有峰的相对保留时间RSD＜0.39%，相对峰面积RSD＜2.3%，表明仪器的精密度符合指纹图谱要求。

2.2.3 重复性试验 取菝葜饮片（YP1）0.5 g，平行6份，按“2.1.1”项下条件制备，再按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，以5号峰（落新妇苷）为参照峰S，计算得到各共有峰的相对保留时间RSD＜1.6%，相对峰面积RSD＜2.7%，表明该方法重复性良好。

2.2.4 稳定性试验 取菝葜饮片（YP1）0.5 g，按“2.1.1”项下条件制备，再按“2.2.1”项下色谱条件分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样分析，以5号峰（落新妇苷）为参照峰S，计算得到各共有峰的相对保留时间RSD＜0.57%，相对峰面积RSD＜1.5%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.5 指纹图谱的建立及相似度评价 取18批菝葜饮片，按“2.1.1”项方法制备，再按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图，导入到中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版），将编号为YP1的样品设为参照图谱，用中位数法将各批次样品计算出的数据进行峰匹配生成指纹图谱共有模式，标定了13个共有峰，结果见图1。相似度计算公式如下[9-10]，式中xi和yi分别代表两组样品的共有峰峰面积。18批菝葜饮片图谱与对照图谱相比，除YP3以外，其余相似度均大于0.9（见表2），表明18批不同来源的菝葜饮片一致性较好，可以用于评价菝葜饮片的综合质量。

图1 18批菝葜饮片HPLC叠加图谱Fig 1 HPLC fingerprint of 18 batches of Smilax china L.

表2 18批菝葜饮片的相似度Tab 2 Similarity of 18 batches of Smilax china L.

2.2.6 共有峰指认 通过与已知混合对照品溶液色谱图比较保留时间，结果见图2～3，13个共有峰共指认出5个峰，其中峰2为绿原酸，峰5为落新妇苷，峰8为槲皮苷，峰9为黄杞苷，峰10为白藜芦醇。

图2 菝葜饮片对照图谱Fig 2 HPLC specific chromatogram of Smilax china L.

图3 混合对照品溶液的HPLC图谱Fig 3 HPLC chromatogram of mixed reference solution

2.2.7 聚类分析 以18批菝葜饮片共有峰峰面积为变量，经Z标准化处理后导入SPSS 25.0软件，采用系统聚类中组间连接的聚类方法，以平方欧氏距离为区间，进行聚类，共聚为三类，其中YP1～YP3聚类一类，YP7～YP10聚为一类，YP4～6、YP11～18聚为一类，结果见图4。

图4 18批菝葜饮片聚类分析图Fig 4 Cluster analysis of 18 batches of Smilax china L.

2.2.8 主成分分析 以18批菝葜饮片共有峰峰面积为变量，经Z标准化处理后导入SPSS 25.0软件，通过降维的手段进行主成分分析，结果Bartlett 球形度检验P＜0.01，表明主成分分析模型成立，以特征值＞1提取了3个主成分，方差贡献率分别是43.428%、24.878%、14.548%，累积方差贡献率为82.854%，见表3，结合碎石图（见图5）分析，3个成分的曲线斜率较大，表明这3个主成分能代表该18批菝葜饮片指纹图谱的大部分信息，可作为综合指标对菝葜饮片的质量进行评价。

图5 碎石图Fig 5 Gravel diagram

表3 主成分特征值及方差贡献率Tab 3 Principal component eigen value and variance contribution rate

从表4主成分载荷系数可知，主成分1主要反映峰1、峰2（绿原酸）、峰3、峰5（落新妇苷）、峰6、峰7、峰8（槲皮苷）、峰9（黄杞苷）、峰11和峰13的信息，主成分2主要反映峰1、峰4、峰10（白藜芦醇）和峰12的信息，主成分3主要反映峰13的信息。

表4 主成分载荷矩阵Tab 4 Principal component load matrix

利用SPSS 25.0软件对主成分载荷进行分析，以主成分载荷系数除以对应特征值的算数平方根得到线性组合系数，有关线性模型如下：

成分1得分＝0.324×峰1-0.378×峰2-0.385×峰3+0.121×峰4-0.253×峰5+0.290×峰6+0.227×峰7+0.297×峰8-0.364×峰9+0.080×峰10+0.292×峰11+0.037×峰12+0.276×峰13

成分2得分＝-0.328×峰1-0.038×峰2+0.108×峰3+0.462×峰4-0.261×峰5+0.205×峰6-0.280×峰7-0.059×峰8-0.007×峰9+0.462×峰10-0.225×峰11+0.428×峰12+0.160×峰13

成分3得分＝0.036×峰1+0.212×峰2+0.174×峰3+0.002×峰4+0.381×峰5+0.432×峰6+0.208×峰7-0.319×峰8+0.225×峰9-0.071×峰10+0.358×峰11+0.210×峰12+0.467×峰13

其中峰1～峰13表示经Z标准化后的13个共有峰峰面积，将标准化后的值代入线性模型，得到18批菝葜饮片的主成分得分，结果见表5，将3个主成分得分导入Origin 2018软件，建立三维散点图（见图6），结果18批菝葜饮片的空间分布分为三组，表明不同来源菝葜的成分组成上存在一些差异，其中YP1～YP3分布较为接近，YP7～YP10分布较为接近，TP4～YP6、YP11～YP18分布较为接近，与聚类分析结果基本保持一致。

图6 18批菝葜饮片主成分得分图Fig 6 Principal component score of 18 batches of Smilax china L.

表5 18批菝葜饮片的主成分得分Tab 5 Principal component scores of 18 batches of Smilax china L.

2.2.8 OPLS-DA 将18批菝葜饮片的共有峰经Z标准化处理后导入SIMCA14.1软件，建立OPLS-DA数字模型。结果显示，该模型解释参数（R2X、R2Y）分别为0.592、0.892，表明模型对变量X（组间差异）、Y（组内差异）的解释率分别为59.2%、89.2%，Q2为0.791，表明该模型的预测能力可达79.1%[11]。采用 SIMCA 14.1绘制得分矩阵图，见图7。可知，18批菝葜饮片可分为3类，YP1～YP3为一类，YP7～YP10为一类，YP4～YP6、YP11～YP18为一类。

图7 18批菝葜饮片OPLS-DA矩阵图Fig 7 OPLS-DA matrix of 18 batches of Smilax china L.

采用 SIMCA 14.1 软件，以Permutations检验（n＝200）对建立的OPLS-DA模型进行验证，详见图8，可知，模型参数（R2、Q2）分别为（0，0.083）、（0，-0.586），Q2的回归线与纵轴相交于0.5以下，表明建立的OPLS-DA模型拟合度好[12]，可用于菝葜饮片质量差异成分的分析验证。

图8 OPLS-DA的置换检验结果Fig 8 OPLS-DA substitution test

变量投影重要性分析值（VIP）是筛选差异性化合物的重要指标，VIP 值越高，表示其对应化学成分对该模型的贡献度越大。采用SIMCA 14.1软件，以VIP值＞1为阈值[13]，筛选影响菝葜饮片质量的标志成分，结果见图9，共筛选出6 个成分，峰号依次为13号峰、6号峰、3号峰、2号峰（绿原酸）、9号峰（黄杞苷）、8号峰（槲皮苷），表明这6个共有峰所对应的化学成分可能是菝葜饮片质量差异的标志成分。

图9 18批菝葜饮片共有峰VIP值Fig 9 VIP value of common peak in 18 batches of Smilax china L.

3 讨论

3.1 色谱条件优化及供试品制备考察

课题组前期考察了不同流动相体系、色谱柱、柱温、流速，根据色谱图信息丰富程度，峰数量以及峰形为条件，最终确定了本文的色谱条件，并在参考文献[14-15]的基础上结合对供试品溶液的制备方法进行考察（不同浓度的溶剂、提取方式、提取时间进行考察），最终发现在70%的甲醇下超声45 min时的供试品溶液中各成分含量最高。

3.2 共有峰指认及存在的不足

18批不同来源的菝葜饮片共标定了13个共有峰，指认出5个成分，分别为绿原酸、落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷、白藜芦醇。不足之处在于仍然有7个成分未被指认，后期将通过液-质联用技术，解析未被指认的共有峰的化学成分以及改用UPLC建立指纹图谱，缩短分析时间。

3.3 多模式化学计量学分析

聚类分析、主成分分析、OPLS-DA可以准确地分析不同来源菝葜之间的差异，从结果来看，三类分析结果一致，其中YP1～YP3为一类，YP7～YP10为一类，YP4～YP6、YP12～YP18为一类，表明不同来源的菝葜饮片的化学组成没有明显的地域性，质量较为稳定。

综上本研究建立了不同来源菝葜饮片的HPLC指纹图谱，通过多模式化学计量学分析对饮片进行综合评价，该结果可为菝葜饮片的质量评价及控制提供参考。