响应面法优化紫山药葛根复合饮品发酵工艺

肖勇生，周杰，钟红英，巫小波，周震，周洋

1.江西省检验检测认证总院食品检验检测研究院（宜春 336000）；2.万载县辉明有机农业科技开发有限公司（宜春 336000）

紫山药属于一种高蛋白、低脂肪、高碳水化合物的植物，既可作为蔬菜，也可作为药材，《本草纲目》和《神农本草经》均记载紫山药具有多种生理功效，有滋肺益肾、健脾止泻、养胃等药用价值，若长期服用，可增强体魄，抵抗各种疾病，并且紫山药中富含的营养物质皂苷、花青素等，有降低血脂、调节血压、抗癌症及降低糖尿病发病率等作用[1-3]。葛根以淀粉和纤维为主，且含有丰富的人体必需氨基酸，其总氨基酸含量达5.10～6.48 g/100 g，并含钙、钾、镁、磷、铁、锌、铜、硒等多种人体必需的矿物质和微量元素[4-5]。关于紫山药和葛根的报道多围绕成分和功效展开，如：朱延胜等[6]研究紫山药中多酚分离纯化及其对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用；李涛等[7]研究紫山药抗性淀粉调节高脂血症金黄地鼠脂质代谢的作用；王彦平等[8]研究紫山药薯蓣皂苷元酶法提取工艺及抗氧化性作用；肖杰等[9]研究紫山药花青素的提纯及其抗氧化性；李东等[10]研究采用微波辅助萃取法提取葛根总黄酮工艺；程浩等[11]采用响应面法优化葛根酸奶发酵工艺。国外，Lin等[12]研究山药不同组织中甾族皂苷含量；Fu等[13]定量分析山药中的尿囊素及尿囊酸组成；Hayakaw等[14]以葛根素、大豆苷元和大豆苷作为葛根质量的评价指标；Kinjo等[15]发现葛属植物除了含有大量异黄酮化合物外，还含有少量芦丁、棚皮素和刺槐等黄酮类化合物。利用由紫山药开发益生菌饮料的鲜有报道，尤其是与葛根配伍的益生菌饮品还未见相关报道。

试验以新鲜紫山药和葛根为原料，以乳酸菌为发酵剂制备紫山药葛根饮品，开发一种兼具紫山药和葛根的营养价值及益生菌益生功能的复合饮品，进一步改善特色高价值农作物利用不充分的问题，从而提高特色高价值农作物产业加工价值和经济效益，在高效率利用当地特色作物资源的同时能较好地提升企业的经济指标，具有广阔的市场前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫山药、葛根（万载县辉明有机农业科技开发有限公司）；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum，LP）BNCC BNCC185392、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus，LA）BNCC138598（北京北纳创联生物技术研究院）；MRS培养基（北京陆桥技术股份有限公司）；耐高温α-淀粉酶、糖化酶（郑州天顺食品添加剂有限公司）；乙醇、聚酰胺粉、甲苯、甲醇（均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；氢氧化钠标准溶液（北京坛墨质检科技有限公司）；芦丁标准品（北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司）。

1.2 仪器与设备

数显恒温水浴锅（HHS21-6，上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；立式高压蒸汽灭菌器（LDZH-150L，上海申安医疗器械厂）；pH计[ST3100，奥豪斯仪器（常州）有限公司]；生化培养箱（BSP-400，上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；超净工作台（BHC-1300A2，苏州净化设备有限公司）；紫外/可见分光光度计（SP-1920，上海光谱仪器有限公司）；高功率数控超声波清洗器（KQ-800KDE，昆山市超声仪器有限公司）；层析柱（青岛科诺赛生物科技有限公司）；分析天平：感量分别为0.01 mg，0.000 1 g和0.001 g，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；多头磁力电动搅拌器（HJ-4A，上海江星仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 紫山药葛根复合饮品制作流程

将紫山药、葛根（质量比2∶1，下同）和水按一定料水比打浆，在搅拌罐中升温至90 ℃添加耐高α-淀粉酶（酶添加量0.2%，酶解pH 6.5）进行液化工艺，酶解60 min后冷却至60 ℃添加糖化酶（酶添加量0.2%，酶解pH 4.4）进行糖化工艺，以碘比色法判断淀粉水解是否完全[16]。酶解完全后升温至95 ℃以上，5 min灭酶后冷却至37 ℃制得紫山药葛根酶解液，接种一定比例的乳酸菌，在一定的温度下恒温发酵一定时间后终止发酵，发酵液过滤后并进行调配，在30 MPa下均质后进行超高温瞬时灭菌灌装，得到紫山药葛根复合饮料成品。

1.3.2 紫山药葛根复合饮品发酵条件单因素试验

1.3.2.1 发酵时间的确定

将紫山药葛根和水按1∶3（g/mL）打浆，植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌按1∶1复配，以1%接种量接种至紫山药葛根酶解液中，在38 ℃分别发酵0，12，24，36，48，60和72 h，以总黄酮和总酸作为评价指标，确定合适的发酵时间。

1.3.2.2 发酵温度的确定

将紫山药葛根和水按1∶3（g/mL）打浆，植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌按1∶1复配，以1%接种量接种至酶解山药浆中，分别在30，33，36，39，42，45和48℃下发酵至1.3.2.1确定的发酵时间，以总黄酮和总酸作为评价指标，确定合适的发酵温度。

1.3.2.3 接种量的确定

将紫山药葛根和水按1∶3（g/mL）打浆，植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌按1∶1复配，分别按0.25%，0.50%，0.75%，1.00%，1.25%，1.50%，1.75%和2.00%的接种量接种至紫山药葛根酶解液中，分别在1.3.2.2确定的发酵温度下发酵至1.3.2.1确定的发酵时间，以总黄酮和总酸作为评价指标，确定合适的接种量。

1.3.2.4 料水比的确定

将紫山药葛根和水分别按1∶2，1∶3，1∶4，1∶5，1∶6和1∶7（g/mL）打浆，将植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌按1∶1复配，以1.3.2.3节确定的接种量接种至紫山药葛根酶解液中，在1.3.2.2确定的发酵温度下发酵至1.3.2.1确定的发酵时间，以总黄酮和总酸作为评价指标，确定合适的料水比。

1.3.3 紫山药葛根复合饮品发酵条件响应面法优化试验

根据响应面软件Design-Expert组合试验设计原理，在单因素试验基础上，采用四因素三水平的响应曲面分析方法。以发酵液中总黄酮和总酸为响应值，以发酵时间、发酵温度、接种量、料水比为自变量，分别以A、B、C、D表示，并以1，0和-1分别代表自变量的高、中、低水平，试验因素水平及编码见表1。

表1 响应面优化试验因素和水平

1.4 指标测定

1.4.1 总酸的测定

紫山药葛根复合饮品的滴定酸度按照GB 5009.239—2016《食品酸度的测定》[17]中规定的酚酞指示剂法进行检测。

1.4.2 总黄酮的测定

试样中的总黄酮经乙醇提取、聚酰胺粉吸附、甲苯和甲醇洗脱净化后，以芦丁为对照样品，采用分光光度法在360 nm波长下测定总黄酮的吸光度，标准曲线法进行定量[18]。

1.5 数据处理

试验数据的处理分别采用Design-Expert 6.0、Microsoft Excel（Office 2007）等软件进行分析及绘制图形。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 发酵时间对结果的影响

发酵时间对紫山药葛根复合饮品总黄酮和总酸结果的影响见图1。结果表明，随着发酵时间的延长，复合饮品总酸呈不断上升趋势，发酵时间60 h时，总酸达到峰值为8.45 g/L，尔后趋于稳定，说明发酵时间对总酸含量有直接的影响，当发酵时间不足时发酵不完全[19]。总黄酮含量随发酵时间的延长变化不显著，呈先下降后轻微上升趋势，可能的原因是发酵过程中黄酮类化合物与蛋白质等组分发生作用，或吸附或沉淀或被氧化，导致这些化合物部分损失[20]。综合考虑，适宜的发酵时间为60 h。

图1 发酵时间对发酵过程中总黄酮和总酸的影响

2.1.2 发酵温度对结果的影响

发酵温度对紫山药葛根复合饮品总黄酮和总酸结果的影响见图2。结果表明，随着发酵温度的提高，复合饮品总酸呈先上升后下降趋势，发酵温度36 ℃时，总酸达到峰值为8.13 g/L，说明益生菌生长过程受到发酵温度的影响，从而影响发酵的速度及发酵过程中总酸的积累[21]。总黄酮含量随发酵温度的提高呈逐步下降趋势，可能的原因是发酵过程中温度的升高对功能成分具有一定破坏作用[22]。综合考虑，适宜的发酵温度为36 ℃。

2.1.3 接种量对结果的影响

接种量对紫山药葛根复合饮品总黄酮和总酸结果的影响见图3。结果表明，随着接种量的增加，复合饮品总酸呈不断上升趋势，接种量低于1.25%时，总酸上升趋势明显，接种量高于1.25%时，总酸呈轻微上升或保持稳定趋势，接种量过小，产酸速率慢，发酵时间延长；接种量过大，产酸速率快，发酵前期酸度上升过快导致发酵后饮料风味变差[23]。总黄酮含量随发酵时间的延长变化不显著，呈先下降后轻微上升趋势，可能的原因是发酵过程中黄酮类化合物与蛋白质等组分发生作用，或吸附或沉淀或被氧化，导致这些化合物部分损失[24]。综合考虑，适宜的接种量为1.25%。

图3 接种量对发酵过程中总黄酮和总酸的影响

2.1.4 料水比对结果的影响

料水比对紫山药葛根复合饮品总黄酮和总酸结果的影响见图4。结果表明，随着料水比中液体占比的提高，复合饮品总黄酮和总酸均呈先上升后下降趋势，料水比1∶3（g/mL）时，总酸达到峰值为7.6 g/L，料水比1∶4（g/mL）时，总黄酮达到峰值为0.339 g/L，这可能是由于增加接种量会导致其代谢产物浓度的增加，不利于菌种的继续生长[25]。综合考虑，适宜的料水比为1∶3（g/mL）。

图4 料水比对饮料发酵过程中总黄酮和总酸的影响

2.2 响应面分析

2.2.1 响应面试验设计和结果

根据表1的试验因素与水平进行试验，试验设计及结果见表2。根据单因素试验结果，选择发酵时间（A）、发酵温度（B）、接种量（C）和料水比（D）进行四因素三水平的Box-Behnken试验设计，共计29次试验，结果见表2，方差分析见表3。

表2 Box-Behnken试验设计与结果

表3 以总黄酮含量为评价指标的响应面试验结果方差分析

2.2.2 响应面试验数据处理及数值分析

利用Design-Expert 6软件进行工艺数据分析，得到总黄酮Y1和总酸Y2与自变量A、B、C、D的多元回归方程：总黄酮（Y1）=0.29+0.016A-0.003 25B+0.002 083C-0.005 833D+0.002 264 2A2-0.003 983B2+0.003 351 7C2-0.006 685 8D2-0.002 25AB-0.007 25AC+0.004AD-0.003 25BC-0.001 75BD-0.012CD；总酸（Y2）=8.70+0.64A-0.089B+0.41C+0.053D-0.51A2-0.41B2+0.22C2+0.027D2-0.022AB-0.30AC-0.32AD+0.15BC-0.33BD+0.11CD。

由表3可知，模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），模型决定系数R2=0.911 8，说明回归方程有较高的拟合度和相关性，模型预测值能较好地反映实际值[26]，可对紫山药葛根复合饮品总黄酮含量进行分析和预测。一次项A、D、交互项CD对结果影响达到极显著水平（P＜0.01），二次项D2、交互项AC对结果影响达到显著水平（P＜0.05）。各因素对总黄酮含量的影响顺序分别是A（发酵时间）＞D（料水比）＞B（发酵温度）＞C（接种量）。

由表4可知，模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），模型决定系数R2=0.922 5，说明回归方程有较高拟合度和相关性，模型预测值能较好地反映实际值，可对紫山药葛根复合饮品总酸含量进行分析和预测。一次项A、C、二次项A2、B2对结果影响达到极显著水平（P＜0.01），交互项AC、AD、BD对结果影响达到显著水平（P＜0.05）。各因素对总酸的影响顺序分别是A（发酵时间）＞C（接种量）＞B（发酵温度）＞D（料水比）。

表4 以总酸为评价指标的响应面试验结果方差分析

2.2.3 各因素交互作用分析

由图5可反映各因素交互作用对响应值的影响，等高线的形状可以反映出交互效应的强弱大小，椭圆形表示2个因素交互作用显著，而圆形则与之相反[27]。可见，发酵时间和接种量、接种量和料水比对总黄酮交互作用响应面曲面较陡，即发酵时间和接种量的交互作用显著、接种量和料水比的交互作用极显著。发酵时间和接种量、发酵时间和料水比、发酵温度和料水比对总酸交互作用响应面曲面较陡，即发酵时间和接种量、发酵时间和料水比、发酵温度和料水比的交互作用显著。其余各因素对总黄酮和总酸交互作用不显著，这与方差分析结果一致。

图5 各因素交互作用对总黄酮和总酸影响的响应面及等高线

2.2.4 验证试验

以总黄酮和总酸为响应指标，拟合出的最佳发酵工艺参数为发酵时间68.26 h、发酵温度35.48 ℃、接种量1.51%、料水比1∶4（g/mL），此条件下总黄酮能力理论值为0.312 g/L，总酸理论值为9.26 g/L。为便于实际操作，修正参数：发酵时间68 h、发酵温度35 ℃、接种量1.5%、料水比1∶4（g/mL），在此优化条件下连续进行3次重复发酵试验，总黄酮和总酸分别为0.314 g/L和9.22 g/L，与理论值相对误差分别为0.64%和0.43%，与理论值基本一致，说明模型拟合性良好，验证模型的有效性，可为实际发酵提供依据。

3 结论

试验以紫山药和葛根为主要原料制作复合益生菌饮品，以总黄酮和总酸为评价指标，在单因素试验的基础上，采用响应面分析法，对紫山药葛根复合饮品的发酵工艺进行优化，获得的最佳发酵条件为发酵时间68 h、发酵温度35 ℃、接种量1.5%、料水比1∶4（g/mL），制得的复合饮品总黄酮和总酸分别为0.314 g/L和9.22 g/L，为紫山药和葛根的综合开发利用和工业化生产提供参考依据。