褐藻寡糖的制备工艺研究

◎ 尹宗美，刘晓菊，刘海燕，李群飞，孙占一

（1.青岛明月海藻生物健康科技集团有限公司，海洋食品加工与安全控制全国重点实验室，山东 青岛 266400；2.上海质量体系审核中心青岛分中心，山东 青岛 266400）

褐藻胶是一种酸性直链多糖，主要是由β-D-甘露糖醛酸（缩写为M）和α-L-古洛糖醛酸（缩写为G）通过1,4-糖苷键连接形成的线性、水溶性、酸性多糖[1]。褐藻寡糖（Alginate Oligosaccharides，AOS）是褐藻胶的寡聚物，一般可通过物理降解法、化学降解法、生物降解法等降解褐藻胶而获得。褐藻寡糖的聚合度一般在2 ～10，解聚后其水溶性增强、易被机体吸收，是一种安全、无毒的化合物。研究表明，褐藻寡糖是一种具有多重生物功能的海洋活性寡糖，具有增强免疫力[2]、抗肿瘤[3]、保护神经元[4]、促进植物生长[5]等功能，在功能食品、医药、化妆品、农业等领域具有广泛的应用前景[6-7]。

1 褐藻寡糖的制备方法

1.1 物理降解法

制备褐藻寡糖的物理降解法有紫外照射法、γ 射线辐照法、微波辐照法和超声波法。在二氧化钛存在的条件下，海藻酸钠水溶液被紫外线照射3 h 以上，可降解产生AOS，且其相对分子质量较低，G/M 比值接近于酸降解法产物[8]。γ 射线照射不会受温度、环境、添加剂等条件的影响，且从能源效率的角度考虑，是目前最有效的物理降解法之一[9]。微波辐照法可避免脱盐，被认为是一种方便、环保、快速获得褐藻寡糖的方法[10]。物理法反应快速、无环境污染，但一般成本较高、效率偏低，其作用机理不明确，有待于进一步深入研究。物理法在提取工艺中，单独使用的情况较少，一般作为其他制备方法的辅助手段，同其他方法联合使用。

1.2 化学降解法

制备褐藻寡糖的化学降解法有酸降解法、碱降解法、氧化降解法3 种。酸降解法使用比较普遍，是制备AOS 的传统方法，一般用到草酸、甲酸和盐酸等[11]。酸法降解褐藻胶的主要反应步骤是共轭酸接收糖苷氧给予的质子，形成的非还原端基末端、碳-正氧鎓离子断裂，接着向碳-氧离子快速给水，可形成还原端基[12]。在反应过程中，褐藻胶的来源、组成以及反应条件等对AOS 的聚合度大小均有较大的影响。LARSEN 等[13]发现，使用1 mol·L-1草酸制备AOS，100 ℃条件下，褐藻胶发生降解反应的比例约为30%。褐藻胶有一定的耐酸性，因此在一般的工艺条件下，不会完全被无机酸降解[14]。CHANDIA 等[15]发现，使用90%浓度的甲酸、100 ℃条件下水解6 h，再使用1.5 mol·L-1的甲酸、相同温度条件下水解2 h，褐藻胶就可以被完全降解。胡博旸等[16]先以褐藻胶为原料，提取出聚甘露糖醛酸、聚古罗糖醛酸两种物质，再利用盐酸降解这两种聚糖，时间分别是1 h、2 h和6 h，分别获得了甘露糖醛酸组分（M1、M2 和M3）和古罗糖醛酸组分（G1、G2 和G3），最后评估甘露糖醛酸、古罗糖醛酸两种物质对超氧化自由基、DPPH 自由基的清除效果，结果显示清除作用均较好，且清除效果与寡糖中还原糖的含量成正相关，说明褐藻寡糖的抗氧化作用与聚合度有关，这对褐藻寡糖的制备工艺提出了更高的要求。

碱降解法是通过β-消除反应，使褐藻胶的糖苷键断裂，但褐藻胶的结构也易因此发生变化，因此此种方法对生产过程的控制要求比较严苛，一般不建议使用这种方法。

酸、碱降解法的优点是提取成本低、操作方便，经过一次降解就可获得不同聚合度范围的寡糖，但对中间过程的控制要求较严格，极易产生有毒、有害的降解产物，不仅会腐蚀仪器，还会造成环境污染。

氧化降解法是先利用H2O2对褐藻胶进行降解，继而利用醇沉技术获得AOS，其副产物是H2O。这种方法的回收率较高，获得的产品纯度也更高，可以避免其他杂质对环境造成污染[17]。但H2O2对褐藻胶的降解机理尚不清晰，有待于继续确认及研究。

1.3 生物降解法

生物降解法产褐藻寡糖是以褐藻胶为底物，利用特异性褐藻胶裂解酶进行酶解，或利用微生物对其进行发酵，包括酶促降解法、产酶微生物全细胞发酵法，该降解技术的关键是寻找合适的酶[18]。

在自然界中，褐藻胶裂解酶主要来源于海洋动物类、海洋微生物、病毒和真菌等[19]，分布较广泛。根据作用底物不同，褐藻胶裂解酶包括3 种类型，分别是Poly-M 特异性裂解酶、Poly-G 特异性裂解酶（可分别作用于M 段、G 段）、双功能的褐藻胶裂解酶（对M 段和G 段都可起作用）[10,20-21]。裂解酶作用是以褐藻胶为底物，经过β-消除机制，切断β-1,4-糖苷键，并在C4、C5 之间形成双键，从而获得不同聚合度范围的AOS 混合物[22-23]。其作用过程主要包含3 个步骤[24]。①中和羧基上的负电荷。②从C5 位上获得质子。③羧基提供电子，在C4、C5 之间形成双键，导致β 消除反应。褐藻胶裂解酶具有底物专一性，因此是制备特殊结构物质的首选。

陈淑琼等[25]以质量浓度8 g·L-1的海藻酸钠为底物，调节pH 值至8.4、温度为30 ℃，采用褐藻胶裂解酶酶解16 h，产物中还原糖的质量浓度可达到1 660 mg·L-1。功效实验结果显示，获得的褐藻寡糖在清除2,2’-联氮双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐自由基（ABTS+）以及抑菌能力方面具有较强的作用，对虾多酚氧化酶的活性具有有效抑制作用，为对虾的贮藏保鲜研究提供一定的理论依据。

褐藻胶裂解酶具有特异性降解作用，因此在酶法制备褐藻寡糖的过程中，酶的获得显得非常重要。近年来，对褐藻胶裂解酶的研究逐渐增多，此酶的制备也实现了产业化，但受制于成本较高问题，仍需对此酶的获得工艺进行深入研究。青岛大学高华教授团队、中国海洋大学的江晓璐教授团队都已将优选褐藻胶裂解酶产酶菌株以及褐藻寡糖作为独立的课题进行研究，其中江晓璐教授团队的褐藻胶裂解酶法制备褐藻寡糖现已在青岛明月海藻生物产业基地实现工业化生产[26]。

产酶微生物全细胞发酵法无须进行酶的分离及纯化，可利用产酶微生物直接进行反应，制备获得AOS，该方法比直接酶降解工艺简单，且生产条件可控，生产周期也更短，更利于规模化生产，产品品质可控。例如，利用微生物混合菌对北方海带（Laminaria hyperborea）叶柄中的褐藻胶进行降解[27]。以海带下脚料为原料，利用产褐藻胶裂解酶棒状杆菌（XS1412C）对其进行发酵（粗酶经分离浓缩后，酶活可由230 U·mL-1提升至1 000 U·mL-1），可得到高纯度AOS 溶液，AOS 总量占比大于80%[28]。以海带为原料，将酶降解和发酵技术相结合，发酵72 h，上清液中AOS 的回收率约为91.7%，纯度为92.6%[29]。

1.4 合成法

合成法中，对酶促合成法的研究较多，利用微生物发酵产生酶，以一定的底物为原料，合成AOS。假单胞菌（Pseudomonas mendocina）NK-01 在限制氮源的条件下，以葡萄糖为底物，可以合成AOS 及中链聚羟基烷酸[30]。门多萨假单胞菌NK-01 可以葡萄糖为底物，通过发酵技术合成AOS[29]。生物合成法使用的原料比较廉价，可准确控制产物的立体化学键形成以及区域选择性，但合成成本较高，暂时无法用于工业化生产[31]。

2 褐藻寡糖的主要功能

2.1 抗氧化活性

褐藻寡糖可有效清除自由基，具有抗氧化活性，其活性大小与G/M、空间排列无关，可能与制备方法、浓度和分子量有关[22,32]。ZHAO 等[33]发现，低分子量褐藻寡糖（小于10 kDa）具有更高的抗氧化活性。在抗氧化活性及作用机理方面，酸降解法制备得到的AOS 与未降解的褐藻胶相似。在抗氧化方面，酶降解法制备获得的AOS 具备共轭烯酸结构，因此具有较好的活性[22]。在抗氧化功能应用领域，酶降解法获得的AOS 效果更优。褐藻寡糖作为抗氧化剂可应用于人类健康等领域[22]。PAN 等[34]发现，褐藻寡糖可激活核因子红素-2 相关因子2（Nuclear Factor Erythrogen-2 Associated Factor 2，Nrf2），提升内源性的抗氧化剂防御系统，显著减轻D-半乳糖诱导的小鼠肾脏的衰老程度。

2.2 抗肿瘤活性

褐藻寡糖在抗肿瘤方面的相关报道可追溯到1985年，但目前作用机制依然不明晰[35]。CHEN 等[36]研究了褐藻寡糖（聚合度2 ～5）对抗骨肉瘤的作用效果，其通过提高患者血清中超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）及谷胱甘肽（Glutathione，GSH）的含量，降低血清中IL-1β 和IL-6 的水平，从而介导抗肿瘤作用，且五糖对骨肉瘤细胞的生长抑制作用显著。近年来，对褐藻寡糖抗肿瘤活性的研究不断增多且更深入，但若要用于治疗肿瘤，还需进行更深入的研究及更多临床试验。

2.3 其他活性

褐藻寡糖除具有上述生物活性外，还具有抗菌、抗炎、抗高血压、抗哮喘、抗糖尿病、抗凝血、抗肥胖及神经调节等活性[37-38]。以白消安诱导的小肠黏膜炎小鼠为模型，AOS 通过提高其小肠细胞簇的数量及比例，增强小肠细胞的发育及功能，达到缓解患者细胞损伤的效果[39]。以从新鲜海带中提取得到的海藻酸钠为原料，通过酸降解法技术制备得到平均聚合度为5 ～23 的褐藻寡糖，其在一定浓度下，对于体外的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都有一定的抑制效果，并且随着浓度的增加，抑制作用增强[40]。YANG 等[41]实验发现，AOS 通过调节JNK-IRS1/PI3K 信号通路，可刺激胰岛素的分泌、控制体内葡萄糖水平升高、提高葡萄糖耐量，不仅可以控制体重，而且对HepG2 细胞具有较强的抗糖尿病活性。

3 结语

AOS 结构较为独特，其生物活性与制备方法、分子量、M/G 比例等多种因素有关。对于AOS 制备技术，酶降解法与其他两种降解方法相比，具有更明显的优势。①酶反应在温和的条件下进行，几乎不需要任何化学试剂，更安全。②酶降解法制备的AOS 属于不饱和寡糖，具有较强的抗氧化功能。但酶解制备技术也存在一定的问题，因其作用底物多为褐藻来源的褐藻胶，产量、性质会因褐藻生长状况、季节等的差异而不同，加上酶的不同也会影响产品的性质等，所以褐藻寡糖的品质难以保持稳定。对于AOS 活性的研究仍主要集中在混合物上，且体内研究较少，结构与生物活性之间的关系研究也有待于进一步深入与明确，这些都是褐藻寡糖进一步开发和应用的阻碍。酸降解法采用的是非选择性的断裂方式[42]，生物活性较低。

褐藻寡糖具有多种生物活性，有着广阔的应用前景，尤其是在海藻肥料领域，褐藻寡糖可诱导植物产生激素，促进作物生长，提高产能，且可以抗病毒等。如果可以提高褐藻寡糖的成本优势，那么其在海藻肥料领域的应用比例将大幅提升，更有助于海藻肥料对农业发展的贡献。随着研究的进一步深入，褐藻寡糖在提高人类健康水平、提升人类生活质量以及提升农作物产量和质量方面，可以做出更大贡献。