孕酮和脂联素受体3 及波形蛋白在胆囊癌组织中的表达及临床意义

张汗青 张黎红 顾国建

胆囊癌（Gallbladder carcinoma，GBC）是胆道系统最常见的恶性肿瘤之一，恶性程度较高。根据Globocan 2020 数据库统计，全球共有84 695 例与GBC 相关的死亡病例[1]。因为GBC 患者早期症状不典型，被发现时通常已达晚期，故预后极差[2]。唯一有可能治愈GBC 的方法是早期根治性手术切除。然而，由于缺乏早期准确检测GBC 的非侵入性方法，根治性切除率较低[3，4]。因此，发现能够早期诊断GBC 的标志物对于患者制定最佳治疗方案和改善预后具有重要意义。

孕酮和脂联素受体3（PAQR3）基因分子量为37 kDa，位于染色体4q21 上。PAQR3 的N 末端朝向细胞质，C 末端位于高尔基体，属于PAQR 家族的第3 个成员[5～7]。研究发现，其在多种恶性肿瘤中低表达，如非小细胞肺癌、贲门癌、食管癌，可以导致肿瘤细胞增殖、新生血管生成、侵袭力增强[8～10]。波形蛋白（Vimentin）是一种分子量为57kDa 的蛋白，在多种恶性肿瘤中高表达，是上皮间质转化（EMT）的典型标志物，且高表达者预后不良[11，12]。

本研究通过探讨PAQR3、Vimentin 与患者预后和临床病理特征之间的关系，以期发现能用于诊断和判断GBC 患者预后的指标。

1 材料与方法

1.1 一般资料收集2019 年9 月～2022 年10 月于我院手术切除的77 例GBC 患者的癌组织标本，患者年龄40～82 岁，平均64.9 岁。另将77 例患者中有癌旁组织标本的23 例作为研究对照。术后病理类型均为腺癌。本研究获得患者知情同意，术后随访3 年。

1.2 方法采用免疫组织化学SP 染色法，将所有石蜡标本切成4μm 的连续薄片，使用二甲苯将标本脱蜡15min，后梯度酒精水化5min；将标本用3%H2O2孵育10min，后将标本浸入柠檬酸缓冲液中煮沸。滴加一抗单克隆兔抗人PAQR3 或Vimentin 抗体（1：100，武汉博士德生物公司）适量过夜。第2天标本在室温下孵育30min，磷酸盐缓冲液（PBS）清洗3 次，每次3min。后滴加适量通用二抗（武汉博士德生物公司），室温孵育15min。用PBS 清洗切片3 次，每次3min。在标本上滴加适量的辣根酶标记链酶卵白素工作液，室温孵育30min。标本上滴加适量的DAB 液，显微镜下观察显色。而后终止反应，将切片苏木素复染，最后脱水，封片[8]。

1.3 结果判定由两位经验丰富的病理科医师对切片进行双盲阅片。根据阳性细胞染色强度评分：0分为无细胞染色，1 分为浅棕色颗粒，2 分为棕黄色颗粒，3 分为褐色颗粒。根据阳性细胞所占比例评分：0 分为阳性细胞数1%～5%，1 分为阳性细胞数5%～50%，2 分为阳性细胞数51%～100%。将两项得分相加即为最后得分，≤2 分为阴性（-）表达，>2分为阳性（+）表达[8]。

1.4 统计学方法所有数据均应用SPSS 23.0 软件进行统计分析。计数资料用n 和%表示，采用χ2检验。P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组织化学染色结果肿瘤细胞浆被染成棕黄色或棕褐色为PAQR3 阳性表达细胞（见图1A），胞浆无染色者为阴性表达细胞（见图1C）。细胞浆被染成棕黄色或棕褐色为Vimentin 阳性表达细胞（见图1B），胞浆无染色者为阴性表达细胞（见图1D）。

2.2 PAQR3 和Vimentin 的表达PAQR3 在邻近癌旁组织中的阳性表达率为78.3%，明显高于GBC组织的48.1%，差异有统计学意义（P=0.011）；而Vimentin 在GBC 组织中的阳性表达率为59.7%，明显高于癌旁组织的13.0%，差异有统计学意义（P<0.001）；PAQR3 和Vimentin 阳性表达率与肿瘤的TNM 分期、病理分级、术后生存时间和淋巴结转移有关（P<0.05），与患者的年龄和性别无关（P>0.05）。见表1。

图1 PAQR3 和Vimentin 在GBC 组织中的表达（×200）

表1 GBC 组织中PAQR3 和Vimentin 蛋白的表达情况[n（%）]

2.3 相关性分析在77 例GBC 患者的癌组织标本中，PAQR3 和Vimentin 均阳性表达的标本11 例，均阴性表达的标本5 例；37 例PAQR3 阳性标本中，Vimentin 阴性表达26 例；46 例Vimentin 阳性表达标本中，PAQR3 阴性表达35 例；PAQR3 和Vimentin 蛋白表达呈负相关（r=-0.589，P<0.001）。

3 讨论

PAQR3 是一种具有抑制多种肿瘤发生、发展的基因[6，7，9，13]，可能机制有：①PAQR3 在细胞质内结合原癌基因丝氨酸/苏氨酸激酶（B-Raf/C-Raf），并将其隔离在高尔基体上，干扰Raf 激酶与其上游和下游信号分子结合，进而抑制大鼠肉瘤（Ras）/Raf/丝裂原活化蛋白激酶（MEK）/细胞外调节蛋白激酶（ERK）信号通路[6，7]。②PAQR3 过表达后，可上调E-钙黏蛋白的表达，下调Vimentin 的表达。进一步研究发现，其可以通过调节TGF-β/Smad 信号通路进而抑制EMT 过程[9]。③PAQR3 能够抑制G 蛋白偶联受体下游的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号传导，进而抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭[13]。

本研究中，我们发现PAQR3 在GBC 组织中的阳性率显著低于邻近癌旁组织，并且与TNM 分期、病理分级及淋巴结转移有关，提示PAQRS 参与GBC 的发生和进展，可作为GBC 诊断的分子标志物。有学者报道，与PAQR3 阴性表达患者相比，阳性表达患者的预后较好[5，9]，与本研究结果一致，提示PAQR3 可成为判断GBC 患者预后的一个重要指标。Tang 等[14]将PAQR3 过表达后，结果显示，人胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力明显下降，提示PAQR3 基因可作为一个潜在的基因治疗靶点。

EMT 是指上皮细胞通过特定程序成为具有基质表型细胞的生物学过程，其特征是细胞黏附性丧失和细胞运动性增强。EMT 是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程[15]。在EMT 过程中，细胞黏附分子（如E-钙黏蛋白）的表达减少，细胞角蛋白转化为基于Vimentin 的细胞骨架，其形态具有间充质细胞的特征[10]。通过EMT，上皮细胞失去细胞极性及表型（如与基底膜的连接），并获得高基质表型，如迁移和侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力。本研究中，我们发现Vimentin 在GBC 组织中的阳性表达率显著高于癌旁组织，并且与TNM 分期、组织学分级及淋巴结转移有关，提示其参与GBC 的发生和进展，可作为GBC 诊断的分子标志物。有研究发现，与Vimentin 阴性表达者相比，Vimentin 阳性表达者预后较差[11，12]，与本研究结果一致。

我们还发现，PAQR3 在GBC 组织中低表达，而Vimentin 在GBC 组织中高表达，二者呈负相关，提示PAQR3 对Vimentin 有负性调节作用，其机制可能与其参与肿瘤的EMT 过程有关[9]。

总之，PAQR3 下调或Vimentin 上调与GBC 发生和进展有关，提示PAQR3 和Vimentin 与GBC的生存和预后相关，今后可能成为GBC 患者诊断和预后的评价指标。