传统发酵食品中功能酶的研究进展

王钰瑶，张 婧，易卓林，赵 海，马 懿

（1.四川轻化工大学生物工程学院，四川宜宾 644000；2.中国科学院成都生物研究所，四川成都 610041；3.成都海关技术中心，四川成都 610041）

人类利用发酵技术对食品进行保藏和加工的历史记载数不胜数，发酵工艺和饮食文化也因为自然环境、地理位置和风俗文化而有所异同。传统发酵食品如白酒、酱油、泡菜等深受大众喜爱，在众人的饮食习惯中占有重要地位[1-2]。这些传统发酵食品的制作与微生物各种代谢途径和复杂的酶催化有着密切的联系，赋予了发酵食品各式各样独特的风味特点。不同的发酵食品中的微生物群落组成不同，其产生的功能酶系也不同。早期，研究者一般通过分离粗酶的方式去研究传统食品发酵过程中的功能酶系，确认了它们的重要贡献。如曲霉的蛋白酶和糖化酶在发酵过程中直接影响着酱油品质[3-4]；酵母菌产生系列脂酶等酶系促进白酒特殊风味物质的产生[5]。然而这种方法研究能获得的信息有限。随着高通量测序技术的快速发展，人们获得了更多关于发酵食品中的核心微生物菌落构成，初步解析群体微生物在发酵过程中的关键的代谢通路和功能酶系，为传统发酵食品风味物质的合成和代谢提供理论依据。目前，常见功能酶系研究的高通量检测手段包括16S rRNA 扩增子分析、宏基因组、宏转录组和宏蛋白质组分析，为深入解析发酵食品的潜在分子机制提供重要技术支持[6]。本文总结回顾了近年来传统研究方法和高通量测序技术对传统发酵食品中功能酶系的预测和分析应用研究，为提升发酵食品工艺和产品品质奠定基础。

1 传统研究方法

1.1 粗酶液分析法

在食品发酵过程中微生物通过产生大量功能酶，催化了一系列复杂风味化合物的产生。早期，研究者直接通过生化方法分离获得发酵过程中产生的粗酶液，并研究了其中一大类酶的酶学性质。孙冰玉等[7]通过研究不同发酵时间的发酵腐乳的粗酶液的酶活，在发酵前期腐乳坯阶段蛋白酶中的碱性蛋白酶活力高，在发酵后期成品阶段中性蛋白酶酶活力更高，而谷氨酰胺酶在前期显著上升而在后期保持恒定。Tian 等[8-9]用不同提取液获取酱油豆曲中粗酶，研究了其中的蛋白酶、淀粉酶、氨基肽酶等关键酶系，结果表明用蒸馏水代替缓冲液提取粗酶的酶活更简便，且酶活大部分无明显差异，同时，也表明酱油的鲜味与米曲霉的碳水化合物降解酶的活性呈正相关。王奕博等[10]对淡豆豉前发酵过程进行分析发现中性蛋白酶、纤维素酶活力总体呈上升趋势，碱性蛋白酶、脂肪酶活力先上升后下降，因此可将蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶的活力变化作为淡豆豉发酵过程进行控制的酶指标。粗酶液分析能直接、简便、真实反映发酵食品在发酵过程中产生的功能酶，通过对其中各种酶类的分析初步评估发酵食品的品质和风味。但是该方法研究的酶系数量有限，只能分析如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等同种功能酶的综合作用，具体酶功能及代谢参与研究不深入，获取的信息相对较少。

1.2 传统分离培养

传统分离培养是指先分离纯化发酵食品中的产酶菌株，然后解析菌株产生的功能酶系。该方法通常利用选择培养基筛选能产生功能酶分解特定底物的微生物，然后对该菌株产生的粗酶进行酶学性质分析。周婉婷等[11]从豆豉中筛选出高产蛋白酶活菌株B3，确定了B3 菌株中与豆豉发酵关键增鲜脱苦风味酶相关的功能基因及其编码的蛋白酶和肽酶。刘学等[12]从浓香大曲中筛选出1 株产甘露聚糖酶的嗜热小孢根霉菌HBFH10，然后克隆这个新型甘露聚糖酶基因，并在毕赤酵母中异源表达后获得重组酶RmMan134。随后用重组酶液处理果浆，提高了多种果汁的澄清度，证实该甘露聚糖酶在果汁加工中具有较好的应用前景。

此外，在苹果醋[13]、四川豆瓣酱[14]、清香型大曲[15]等其他发酵食品的研究中，大量研究者通过传统分离培养的方法分离各种产酶微生物，确认了乙醇脱氢酶、蛋白酶等功能酶系在食品发酵中的重要作用以及动态变化（详见表1）。该方法能够从传统的发酵食品中挖掘到特定的酶系，但对于不可培养的微生物而言，该方法存在缺陷导致无法获得目的酶基因。因此，为了更精准解析功能酶的具体作用，以及分析难以通过微生物纯培养获取的功能酶价值，在研究中，需要采用一些能直接获得酶基因并进一步进行酶功能分析的方法。

表1 近年传统发酵食品中功能酶的种类及作用研究概况Table 1 An overview of the types and functions of functional enzymes in traditional fermented foods in recent years

2 高通量测序技术

2.1 基于16S 和ITS 测序进行微生物酶功能预测

PICRUSt 全称为Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States，是最早被开发的基于16S rRNA 基因序列预测微生物群落和分析微生物功能酶系的方法[29]。该方法将测序获得的微生物与已公布的物种序列比对，推断微生物潜在的代谢功能和功能酶系。周亚澳等[30]基于16S 测序结果利用PICRUSt 软件对宜昌腊肠中细菌的基因功能进行预测，并进行KEGG 功能注释，预测结果表明细菌在碳水化合物代谢、多糖生物合成和代谢方面的酶系更为丰富，这些都与乳酸杆菌的相对丰度显著相关。熊香元等[31]在米粉发酵过程中使用PICRUSt 进行了酶基因功能预测，KEGG 分析预测到与糖代谢、脂代谢、氨基酸代谢等与食品风味形成相关的代谢途径丰度更高。且活跃酶更多，如异构酶中的磷酸甘油酸变位酶、氧化还原酶类中的L-乳酸脱氢酶和水解酶类中的金属肽酶等。

近期，停止更新的Greengene 数据库限制了PICRUSt 的功能预测范围，满足不了当前的研究需求，于是开发团队升级了软件，正式公布了PICRUSt2[32]。升级后的PICRUSt2 将待预测的OTU 代表序列置于软件已有的系统发育树进行物种注释，使得PICRUSt2 不但可以用于16S 细菌、古菌的功能预测，也可以用于18S、ITS 真菌、藻类的功能预测，这些物种的数据库也在不断更新。王阿利等[33]基于16S rRNA 测序和ITS1 测序技术进行酱油发酵体系中的微生物多样性、群落组成、预测功能的分析，结果表明酱油发酵体系中的细菌功能主要集中在氨基酸代谢途径，真菌功能主要集中在由曲霉具有的淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶等多种复合酶系参与的脂肪和碳水化合物代谢。这一方法也使用在泡菜[22]、香肠[24]的酶功能预测中。

PICRUSt 是测序后利用物种注释匹配至数据库进行功能基因预测，其准确度一定程度上取决于物种注释结果和数据库的相似度。因此，PICRUSt 可以对菌群功能和酶功能进行初步预测，为后续研究提供大致方向。但是该方法预测结果不能真实反应发酵过程功能酶系的变化趋势，预测结果与实际酶基因转录表达情况存在较大差别。

2.2 宏基因组测序分析

宏基因组学是指特定环境中全部微小生物遗传物质的总和，其中包括可培养的和不可培养的微生物[34]。该方法绕过菌种分离纯培养，实现从DNA 水平直接地获得元基因组数据，系统地分析发酵食品微生物的代谢、群落之间的相互作用及对环境的反应机制。

在白酒酿造中，利用宏基因组学技术手段研究对发酵过程中的酶系进行分析和预测。如Zhang等[35]对浓香型大曲发酵过程进行宏基因组测序，并对其中40.66%的个体特征进行了分类和注释，KEGG注释及相关网络分析，表明淀粉酶活性与许多碳代谢相关途径呈正相关，其中α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶丰度最高，这些功能酶信息为提高和稳定大曲质量提供了理论依据。此外，Yang 等[36]将中温大曲发酵过程的宏基因组测序结果也进行KEGG 分析，获得了注释代谢途径和酶的绝对标准化丰度列表，可视化了发酵过程中主要微生物分类群与特定功能酶之间的相互联系，其中推测阿魏酸羧酸裂解酶有助于风味物质的形成与积累。

除此以外，在其他如羊肉香肠[23]、酸鱼[25]、醋[21]、普洱茶[27-28]、其他发酵酒[19-20,37]等发酵食品的研究中也有研究者使用宏基因组学分析了发酵过程中功能酶系，基于功能酶的动态变化或对风味物质的影响来对这些发酵食品的发酵工艺进行指导。基于功能酶基因注释，宏基因组检测也可以解析产品某些特性，如有助于风味物质产生的功能基因簇和途径。此技术对认识和利用95%以上的未培养微生物提供了一条有效的途径。总体而言，宏基因组更偏向于定性分析，相较其它测序方法能获取更广的功能酶信息，但是无法真实反应微生物的功能酶系的活跃状态。

2.3 宏转录组测序分析

基于DNA 的分析方法不能区分微生物的生存状态。存在于发酵原料中，不论死或者活微生物的DNA，在整个发酵过程中都长期稳定存在（且可扩增）。因此，需要利用另一种技术方法来确保检测到的微生物是存活且具有代谢活性的。

宏转录组学是指特定时期的环境样本或组织样本中所有的微生物的RNA 的集合。以所得全部RNA为研究对象进行宏转录组测序。这种技术具有宏基因组技术的许多优点，还能检测环境中的活性微生物与转录本并对活性功能进行分析，进而比较不同环境下的差异表达基因和差异功能途径，对研究发酵食品的微生物及其产酶特性具有更深的分析深度[38-39]。

如今宏转录组测序技术已经广泛被应用来检测各种传统食品（如泡菜[40-41]、镇江香醋[21]、和各种香型白酒[42-43]等）发酵过程中微生物和酶系的多样性，为功能菌株的筛选和分离、风味酶的表达和表征提供了有价值的参考（见表1）。Zhao 等[44]采用宏转录组学的技术对四川工业萝卜泡菜在发酵过程中的活跃功能酶基因进行KEGG 注释，随发酵时间增加，代谢途径相关基因丰度上升，其中的碳水化合物和氨基酸代谢活跃，这些代谢途径的丰度增加可能与工业萝卜泡菜风味形成有关（糖基转移酶和葡萄糖苷水解酶主导发酵过程且助于风味形成）。Yi 等[45]基于宏转录组对浓香型白酒大曲宏转录组数据进行注释，存在超过996 种碳水化合物活性酶系，其中表达最多的糖苷水解酶主要分为纤维素酶、细胞壁延伸酶、细胞壁脱支酶和寡糖降解酶，研究它们在降解白酒发酵中的协同作用，为优化白酒生产和质量提供方法。

利用宏转录组测序技术对传统食品发酵过程中的酶系进行分析时，对测序样品本身RNA 的质量有一定的要求。实际环境中RNA 稳定性不高，如提取的RNA 质量相对较低，将对测序结果产生不利影响，而且这是一个瞬时状态下生物信息的提取，这也是宏转录组测序所获得信息相较宏基因组更少的一个原因。

2.4 宏蛋白质组学分析

宏蛋白质组学是通过大规模地定性和定量分析蛋白质，从而分析环境中的微生物群落的一门学科。但由于其蛋白提取的复杂性，目前还处于不断完善阶段。但蛋白水平的研究可用于探索特定时间点发酵过程在蛋白质水平上的关键微生物、关键酶、代谢途径、功能蛋白标志物和蛋白质相互作用，并增强对生态系统的理解[46]。宏蛋白质组学可以进行微生物群落的一致性、活性和功能分析，能够提供宏基因组无法获取的信息。

为了研究多种糖化酶对中国白酒发酵的协同作用，Wang 等[47]通过宏蛋白组学分析鉴定了白酒发酵时酒醅中的51 种碳水化合物水解酶，且发现酒醅中80%的酶来自酒曲。酒曲中的曲霉、根霉和毛霉所产的α-淀粉酶和葡糖淀粉酶与发酵过程中的淀粉水解和乙醇生产呈正相关，是白酒发酵中与酒精发酵相关的关键糖化酶。通过宏蛋白组确定多种糖化酶对白酒发酵中酒精产量的协同作用，为后续添加糖化酶的比例来提高糖化和酒精发酵的效率提供理论依据。范伟业[48]利用宏蛋白质组学技术对浓香大曲中的功能酶蛋白进行组成分析，揭示了浓香大曲中参与氧化还原过程这一生物途径的酶的数量最多，与生产风味物质途径的酶一样，都与酱香型白酒的酶类相差甚远。此外，也有学者利用宏蛋白质组对清香型白酒大曲[18,49]、酱香型白酒[50-51]及普洱茶[26]中的功能酶系及其作用进行了研究分析，具体见表1。

然而宏蛋白质组测序由于样本需要提取后的蛋白达到标准后才能用于分析，又由于微生物群落的复杂性和异质性，目前宏蛋白质组学研究构建的序列数据库数量不多。因此，将宏蛋白组用于发酵食品中酶的研究是一件相对不太成熟的研究方法。不过随着蛋白质组学被应用得越来越多，相信未来蛋白质组学会建立更多特异性的数据库供给使用，越来越多地用于发酵食品的研究中。

2.5 多项技术交叉运用

上述多种研究方法由于技术的差异获取酶系信息有差异，从粗酶和纯培养只能研究少数几类酶的性质，而后续发展的高通量测序技术能获取到更庞大的酶基因功能信息，不同的技术所能获得的酶信息数据数量差异显著。如表2 所示，通过扩增子测序技术和基于16S rRNA 数据库的PICRUSt 预测，在发酵米粉的15 个样中，可能存在1400 余种酶基因，但其预测结果与实际酶基因转录表达情况存在较大差别。通过宏基因组，不仅能确认功能酶基因的存在，而且发现数量还远大于基于扩增子的预测分析，如在浓香白酒大曲中发现265147 个功能注释的酶基因，但是该方法难以反应微生物功能酶系的活跃状态。而宏转录组和宏蛋白组可有效解析发酵系统中存在的活跃功能酶系，但由于测序样本提取难度大，测序获取的数据量信息有限，因此相较于宏基因组，宏转录组和宏蛋白组测序后获取的功能酶量偏少；如通过宏转录组在酱香型大曲发酵中发现38899 个基因，其中有230 种碳水化合物活性酶；通过宏蛋白组发现的数量更少，在汾酒大曲中仅鉴定成功了122 个酶蛋白。

表2 不同研究方法在发酵食品酶系数量差异对比Table 2 Comparison of the differences in the number of enzymes in fermented foods by different research methods

随着科技的发展，如今不再是仅仅寻求单一的手段对传统发酵食品发酵过程中微生物酶进行研究分析，而是常常多种方法一起使用，从不同角度去获取生物酶信息并解析其对发酵的影响。学者李昊颖[52]利用微生物组分析得到米酒发酵过程中微生物群落明显的变化，一些种属的丰度与发酵相关酶活性有较好的正相关性。宏蛋白组也分析得蛋白主要来源于原料和根霉属微生物，其中来自根霉的葡萄糖淀粉酶-1 和蛋白酶-2 均在丰度与相关性上表现出与发酵过程高度相关性。后续在米酒发酵前添加蛋白酶，实验结果表明酸性蛋白酶是米酒糖化酶系的重要组成之一，在米酒初始糖化过程中会影响其发酵表现。Chun 等[53]通过结合宏基因组学、宏转录组学对甘让酱油的发酵进行分析，揭示了蛋白酶、脂肪酶等酶参与发酵过程重要代谢途径，如氨基酸代谢、TCA 循环代谢、脂质代谢。当多种研究方法共同使用时，可以得到多个方面验证后的结果，进行更系统深入地解析发酵过程。

利用高通量测序技术对发酵食品进行分析后将获得大量的功能酶序列，如何将这些基因信息直观地表达并进行后续的研究以及应用，则需要借助实验室分子克隆和蛋白质工程等技术。针对生产高效功能酶的未知菌，为了获取纯酶以进行后续酶学性质分析，利用合适的表达系统进行异源表达是一种操作简单、培养周期短且生产成本较低的有效方法。

Ali、Yi[43]所在的团队基于宏转录组学直接获取了浓香型大曲中的β-葡聚糖酶和高表达热稳定的α-淀粉酶基因（NFAmy13A和NFAmy13B），将基因在大肠杆菌表达系统中进行异源表达后获取纯酶进行酶学性质分析研究，证实了在大曲内两个淀粉酶基因之间的高效竞争协同作用。岳晓平等[54]通过对发酵豆制品样品进行宏基因组测序，从中获得米曲霉酸性蛋白酶基因pepA，在毕赤酵母GS115 中进行异源表达后，分析重组蛋白酶的酶学特性，为米曲霉来源的酸性蛋白酶规模化生产提供依据。

3 结论与展望

如今种类繁多的传统发酵食品，大多依然保持着传统的生产技艺，因此保持传统发酵食品的特色传承以及进一步优化或自动化的需求被研究者越发重视。这些特性的研究、传承与进一步更新都与其中的微生物所产生的酶在发酵时参与的各种代谢密切相关。通过多种技术手段研究分析，发现豆制品如酱油、腐乳的发酵中高酶活力的蛋白酶、谷氨酰胺酶等酶决定了最终发酵产物的质量与风味构成。发酵酒中的碳水化合物代谢途径中的糖苷水解酶、氨基酸代谢通路的转氨酶和风味形成相关的酯化酶对酒质的影响极大。发酵醋的乙醛脱氢酶的表达量较高，参与氨基酸代谢的酶基因会更为活跃。发酵蔬菜中水解相关酶类也会随着发酵的进展而更加活跃。肉制品的发酵会产生降解生物胺的酶与催化酯合成的酶类如羧基酯酶。普洱此类发酵茶会因为活跃的果胶酯酶和木聚糖酶等酶类参与多糖降解及果胶水解代谢而产生醇厚的香气。然而这些研究所采用的技术还存在不同的局限性，包括以下几点：

a.传统分离培养仅能研究可培养微生物所产生的同种类酶；b.基于16S rRNA 和ITS 测序的PICRUSt 分析预测所得结果与实际酶基因表达存在差异；c.宏基因组无法区分微生物功能酶的活跃状态；d.宏转录组的样品收集难度大；e.宏蛋白组取样困难且数据库构建不完全，在进行比对预测时信息获取度低。因此在实际应用中，需要结合研究目的对使用的技术进行选择，尽可能采取更多的研究手段才能更准确地对发酵食品的发酵机理和质量控制进行研究与探讨。最后还可以在高通量技术分析基础上，通过异源表达对传统食品的具体功能酶进行获取与研究，为从发酵食品中获取可工业化生产的酶制剂提供理论依据与实践基础。