脱除不同溶解性内源蛋白质对早籼米粉理化性质的影响

李欣倩，刘锦华，王若伊，封 琴，冯慕心，陆春苗，赵渠加，杨 英

（稻谷及副产物深加工国家工程研究中心，中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南长沙 410004）

大米粉是一种重要的谷物食品原料，其理化性质对米糊、米饼等米制品的品质具有重要的影响[1-2]。在大米粉中，淀粉含量高达80%，是大米粉具有糊化性能的基础，但蛋白质作为第二大组分（含量6%～7%），对大米粉的糊化特性具有显著影响[3-6]。大米蛋白质由水溶性清蛋白、盐溶性球蛋白、醇溶蛋白和碱溶性谷蛋白组成，目前已有研究发现这些溶解性不同的内源蛋白质对大米粉的成糊特性具有不同的影响：脱除清蛋白能显著降低非糯性大米粉的糊化温度和糊化粘度[7]，但对糯米粉的成糊特性没有显著性影响[8]；脱除球蛋白能提高糯米粉的成糊温度，但会降低成糊粘度、崩解值和回生值[9]；脱除醇溶蛋白能降低非糯性大米粉的成糊粘度和崩解值[10]；脱除谷蛋白能降低不同品种大米粉的成糊温度、粘度、崩解值和回生值[11]。但是，关于不同溶解性内源蛋白质对大米粉成糊后水分结合状态、流变学特性、冻融稳定性等其他理化性质影响的研究还不够充分，尤其少见涉及早籼米粉的报道。

早籼米粉是生产米粉（米线）等消费量庞大的米制品的优质原料[12-13]，研究溶解性不同内源蛋白质对早籼米粉理化性质的影响对提高相关米制品品质具有重要的意义，也有利于充分高值化利用产量大、耐储藏但碎米率高[14]的早籼米。能够依次脱除清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的Osborne 法[15]是一种成熟、简单且安全的脱除大米粉不同溶解性内源蛋白质的方法，在工业化生产中具有良好的应用前景。因此，本文采用Osborne 法依次脱除早籼米粉的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，对比研究不同溶解性内源蛋白质对早籼米粉溶解度、膨胀度、成糊特性及其糊化后与水结合情况、流变学特性和冻融稳定性的影响规律，以期为利用不同溶解性内源蛋白质调控早籼米粉理化性质以提高相关米制品品质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

早籼米粉（RF）由产自安徽南陵县新塘米厂的珍珠三号早籼米经干磨过100 目筛制成；氯化钠、无水乙醇、氢氧化钠 分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

HH-2 数显恒温水浴锅 上海力辰科技有限公司；101-1 电热干燥鼓风箱 北京中兴伟业仪器有限公司；F-3L 玻璃反应釜 巩义市科华仪器设备有限公司；L530 离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；KDN-08C 数显控温消化炉 上海力辰仪器科技有限公司；K9840 自动凯氏定氮仪 济南市海能仪器股份有限公司；SpectraMax i3X 酶标仪 美谷分子仪器有限公司；RVA-4 快速粘度分析仪 瑞典波通公司；DHR-2 流变仪 美国TA 公司；NM120型低场核磁共振 上海纽迈电子科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 脱除不同种类蛋白质大米粉样品的制备 参考张敏等[16]、孙媛等[17]描述的Osborne 方法，首先依次用蒸馏水、5% NaCl、70%乙醇和0.2% NaOH按料液比1∶10 g/mL 在40 ℃下浸泡早籼米粉脱除其中的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，脱除后离心并用蒸馏水洗脱2 次，然后在40 ℃下干燥样品，最后将样品磨粉过100 目筛，获得依次标记为RF-Alb、RF-AGlo、RF-AGPro 和RF-AGPGlu 的早籼米粉样品。采用二奎啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒[18]测定样品脱除液中的蛋白质含量，以同种脱除液中的蛋白质含量不再变化的时间作为该脱除处理的结束时间。BCA 测试操作如下：取牛血清蛋白标准品，用PBS 溶液稀释至浓度为1.0 mg/mL，按梯度稀释配制成标准测定液，加入200 µL BCA 工作液，37 ℃放置30 min，于562 nm处测定吸光度，绘制标准曲线，其中横坐标为蛋白质标准浓度，纵坐标为吸光度；取20 µL 待测液，加入200 µL BCA 工作液，充分混匀后，37 ℃静置30 min后562 nm 处测定吸光度，根据标准曲线计算脱除液中蛋白质的含量。

1.2.2 早籼米粉样品中总蛋白质含量的测定 按照GB 5009.5-2016 中凯氏定氮法[19]测定早籼米粉样品的总蛋白含量。

1.2.3 早籼米粉溶解度与膨胀度的测定 取1.2.1 中的样品，配制成2%的米粉浆，分别在40、75 和90 ℃恒温水浴中加热搅拌30 min，冷却后4000 r/min离心15 min，将上清液倒入铝盒中于105 ℃干燥至恒重，称重得到水溶大米粉重量，沉淀为膨胀大米粉。计算公式如下：

1.2.4 早籼米粉成糊特性的测定 采用快速粘度分析仪Standard 1 程序测定早籼米粉样品的成糊特性，测定参数为960 r/min 运行10 s 后，保持160 r/min，50 ℃恒温1 min，再以12 ℃/min 升温至95 ℃，持续时间为2.5 min，然后以12 ℃/min 降温至50 ℃，持续时间为2 min，得到糊化曲线、糊化温度、峰值粘度、终值粘度、崩解值和回生值。

1.2.5 早籼米粉糊水分结合状态的测定 采用低场核磁共振仪测试经1.2.4 形成的早籼米粉糊的水分结合状态，具体测试条件为SW=200 kHz、TW=2500 ms、NS=8、NECH=4000，数据经单组分反演拟合得到样品的横向弛豫时间T2[20]。

1.2.6 籼米粉糊流变学特性的测定 采用流变仪测试经1.2.4 形成的早籼米粉糊的黏弹性，选用40 mm平板，设置0.1 cm 间隙。参考Yang 等[21]描述的方法，具体测试条件如下：先在25 ℃、1 Hz 下对样品进行0.1%～100%应变扫描确定线性应变区间，后在该区间内进行0.1～1 Hz 的频率扫描，获得样品的储能模量（G′）、损耗模量（G′′）和损耗角正切值tanδ。

1.2.7 籼米粉糊冻融稳定性的测定 参考唐双[22]描述的方法，取经1.2.1 处理获得的早籼米粉样品加蒸馏水配制成5%（w/w，以干基计）的粉浆样品，沸水浴糊化30 min 形成早籼米粉糊样品。记50 mL 离心管的重量为m1，转移20 g 样品至离心管中并称重，记m2，-18 ℃冷冻22 h 后放置在30 ℃水浴下解冻2 h，作为一个冻融循环。经过1、3、5 次循环后，4000 r/min 离心20 min，去掉上清液，称取离心管和沉淀重，记为m3，按以下公式计算：

1.3 数据处理

试验数据采用SPSS22 进行显著性分析（P<0.05），Origin 2018 作图，所有试验均有2～3 次平行，测试结果用“平均值±标准偏差”表示。

2 结果与分析

2.1 早籼米粉样品的总蛋白质含量

早籼米粉及其依次脱除清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白样品的总蛋白质含量分别为8.66%、7.78%、7.47%、7.14%和0.71%。由此可算出，依次脱除的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白含量分别为0.88%、0.31%、0.33%和6.43%，分别占脱除总蛋白质含量的11.07%、3.90%、4.15%和80.88%。脱除4 种蛋白质后，残留的0.71%蛋白质很可能是淀粉颗粒相关蛋白[23]。

2.2 脱除不同溶解性内源蛋白质对早籼米粉溶解度和膨胀度的影响

大米粉在糊化过程中，淀粉颗粒会吸水膨胀直至崩解。已有研究表明，淀粉颗粒的结晶结构在55 ℃下开始减少并在75 ℃下被完全破坏[24]，而早籼米淀粉的糊化温度范围是60～75 ℃[25]。因此，本文根据温度对淀粉颗粒结构的影响程度，选择在40、75 和90 ℃下研究脱除不同溶解性内源蛋白质对早籼米粉溶解度和膨胀度的影响。

不同溶解性内源蛋白质对早籼米粉在40、75和90 ℃下的溶解度和膨胀度的影响分别如图1 和图2 所示。所有早籼米粉样品的溶解度和膨胀度均随温度的升高而提高，到达90 ℃时提高幅度都最大。具体而言，从40 ℃到90 ℃，原早籼米粉样品RF及其依次脱除清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的样品RF-Alb、RF-AGlo、RF-AGPro 和RF-AGPGlu的溶解度分别增大了3.1%、2.75%、3.51%、3.87%和18.6%，对应的膨胀度分别提高了4.72%、4.64%、4.69%、6.32%和14.22%。显然，不同溶解性内源蛋白质对早籼米粉的溶解度和膨胀度具有显著性影响（P<0.05）。

图1 脱除不同溶解性内源蛋白质对早籼米粉溶解度的影响Fig.1 Effects of removing different soluble endogenous proteins on the solubility of rice flour

与RF 相比，RF-Alb 的溶解度在75 和90 ℃下显著减小（P<0.05），而膨胀度在40 和75 ℃下显著降低（P<0.05），但在90 ℃下无显著变化（P>0.05）。该结果表明，脱除清蛋白会抑制早籼米粉溶解，并在中低温下抑制其膨胀。与RF 相比，RF-AGlo 的溶解度在不同温度下均显著增大（P<0.05），而膨胀度在40 和75 ℃下显著降低（P<0.05），但在90 ℃下无显著变化（P>0.05）；与RF-Alb 相比，RF-AGlo 的溶解度在不同温度下均显著增大（P<0.05），但膨胀度无显著变化（P>0.05）。该结果表明，脱除球蛋白会促进早籼米粉溶解，但对其膨胀影响有限。与RF 相比，RFAGPro 的溶解度在75 ℃下显著减小（P<0.05），但在90 ℃下显著增大（P<0.05），而膨胀度在40 和75 ℃下显著降低（P<0.05）；与RF-AGlo 相比，RF-AGPro的溶解度在不同温度下均显著减小（P<0.05），而膨胀度在40 ℃下显著降低（P<0.05），但在90 ℃下显著提高（P<0.05）。该结果表明，脱除醇溶蛋白会抑制早籼米粉溶解，但在高温下促进其膨胀。与RF 相比，RF-AGPGlu 的溶解度在40 ℃下显著减小（P<0.05），但在90 ℃下大幅增加，而膨胀度在40 和75 ℃下均显著降低（P<0.05），但在90 ℃下大幅提高；与RF-AGPro 相比，RF-AGPGlu 的溶解度在75 ℃下显著增加（P<0.05）并在90 ℃下大幅提高，而膨胀度在75 ℃下显著降低（P<0.05），但在90 ℃下大幅提高。该结果表明，脱除谷蛋白会在中温下促进早籼米粉溶解，并在高温下大幅促进其溶解和膨胀。因此，脱除球蛋白和谷蛋白可促进早籼米粉溶解，而脱除醇溶蛋白和谷蛋白可在高温下促进早籼米粉膨胀。

2.3 脱除不同溶解性内源蛋白质对早籼米粉成糊特性的影响

经RVA 测定，依次脱除清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白对早籼米粉的成糊曲线具有不同的影响（如图3 所示），对具体成糊特性参数的影响见表1。与RF 相比，RF-Alb 的糊化温度没有显著性差异，峰值粘度、终值粘度、崩解值和回生值分别降低16%、21%、50%和43%，说明脱除清蛋白会降低早籼米粉成糊的峰值粘度、终值粘度、崩解值和回生值。RF-AGlo 与RF 相比，糊化温度提高1.4%，峰值粘度、终值粘度、崩解值和回生值分别降低25%、26%、54%和40%；与RF-Alb 相比，糊化温度提高1.9%，峰值粘度降低11%，终值粘度、崩解值和回生值均无显著性差异（P>0.05）。该结果表明，脱除球蛋白会提高早籼米粉的糊化温度并降低其峰值粘度。RF-AGPro 与RF 相比，糊化温度无显著性差异（P>0.05），峰值粘度、终值粘度、崩解值和回生值分别降低18%、30%、44%和56%；与RF-AGlo 相比，糊化温度降低2.3%，峰值粘度提高10%，终值粘度、崩解值和回生值均无显著性差异（P>0.05）。该结果表明，脱除醇溶蛋白会降低早籼米粉的糊化温度并提高其峰值粘度。RF-AGPGlu 与RF 相比，糊化温度、峰值粘度、终值粘度、崩解值和回生值分别降低1.9%、36%、39%、17%和33%；与RF-AGPro 相比，糊化温度没有显著性差异（P>0.05），峰值粘度和终值粘度分别降低22%和12%，崩解值和回生值分别提高49%和53%。该结果表明，脱除谷蛋白会降低早籼米粉的糊化温度、峰值粘度和终值粘度并提高其崩解值和回生值。

表1 脱除不同溶解性内源蛋白质对早籼米粉成糊特征参数的影响Table 1 Effects of removing endogenous proteins with different solubility on the pasting characteristic parameters of rice flour

图3 脱除不同溶解性内源蛋白质对早籼米粉成糊曲线的影响Fig.3 Effects of removing different soluble endogenous proteins on the pasting curve of rice flour

由于早籼米粉成糊的糊化温度、峰值粘度、终值粘度、崩解值和回生值分别代表其糊化所需温度、与水结合能力、糊化后形成凝胶的能力、颗粒结构破裂程度和回生速度[26]，根据上述分析结果，脱除球蛋白可提高早籼米粉的糊化温度，而脱除醇溶蛋白和谷蛋白则相反；脱除清蛋白、球蛋白和谷蛋白可抑制早籼米粉与水结合，而脱除醇溶蛋白则相反；脱除清蛋白和谷蛋白可抑制早籼米粉糊化后形成凝胶；脱除清蛋白可抑制早籼米粉颗粒结构破裂和回生，而脱除谷蛋白则相反。

2.4 脱除不同溶解性内源蛋白质对早籼米粉糊水分结合状态的影响

低场核磁共振参数横向弛豫时间T2以1 和40 ms 为界可将水分状态区分为强结合水、弱结合水和自由水[20]。早籼米粉糊化后的弱结合水含量和峰值时间可以反映其与水结合的情况。含量越高，结合水越多；峰值时间越短，与水结合的强度越大[27]。依次脱除清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白对早籼米粉糊化后弱结合水含量和峰值时间的影响如图4 所示。与RF 相比，RF-Alb 的弱结合水含量和峰值时间无显著性差异（P>0.05），说明脱除清蛋白不影响早籼米粉糊化后与水结合的情况。与RF 和RF-Alb相比，RF-AGlo 的弱结合水含量均无显著性差异（P>0.05），但弱结合水峰值时间分别缩短16%和19%，说明脱除球蛋白会提高早籼米粉糊化后与水结合的强度。与RF 和RF-AGlo 相比，RF-AGPro 的弱结合水含量分别降低7%和无显著性差异（P>0.05），弱结合水峰值时间分别缩短10%和延长7%，说明脱除醇溶蛋白会降低早籼米粉糊化后与水结合的强度。与RF 和RF-AGPro 相比，RF-AGPGlu 的弱结合水含量分别降低21%和14%，弱结合水峰值时间分别缩短45%和38%，说明脱除谷蛋白会显著降低早籼米粉糊化后的弱结合水含量并提高其与水结合的强度。因此，脱除谷蛋白可降低早籼米粉糊化后的弱结合水含量，而脱除球蛋白和谷蛋白均可提高其糊化后与水结合的强度，但脱除醇溶蛋白则相反。

图4 脱除不同溶解性内源蛋白质对早籼米粉糊化后弱结合水含量和峰值时间的影响Fig.4 Effects of removing different soluble endogenous proteins on the content and peak time of weakly bound water of gelatinized rice flour

2.5 脱除不同溶解性内源蛋白质对早籼米粉糊流变学特性的影响

流变学参数损耗角正切值tanδ和储存模量G′与损耗模量G′′之差（G′-G′′）可用于表征早籼米粉糊的流变学特性[28]。tanδ小于1 时体系呈现似固状态，反之则呈现似液状态[29]。G′-G′′数值越大说明弹性越大，反之则黏性越大[20]。依次脱除清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白对早籼米粉糊化后流变学特性的影响如图5 所示，所有样品的tanδ都小于1，G′-G′都大于0，说明早籼米粉糊化后呈现似固状态并表现出弹性。与RF 相比，RF-Alb 的tanδ和G′-G′′均无显著性差异（P>0.05），说明脱除清蛋白不影响早籼米粉糊化后的流变学特性。与RF 和RF-Alb 相比，RF-AGlo 的tanδ均无显著性差异（P>0.05），但G′-G′′都降低9%，说明脱除球蛋白不影响早籼米粉糊化后的状态，但会降低其弹性。与RF 和RF-AGlo 相比，RF-AGPro 的tanδ分别降低26%和20%，G′-G′′分别提高26%和38%，说明脱除醇溶蛋白会增强早籼米粉糊化后的似固状态并提高其弹性。与RF 和RF-AGPro 相比，RF-AGPGlu 的tanδ分别降低28%和无显著性差异（P>0.05），G′-G′′分别降低23%和39%，说明脱除谷蛋白不影响早籼米粉糊化后的状态，但会降低其弹性。因此，脱除醇溶蛋白可增强早籼米粉糊化后的似固状态，而脱除球蛋白和谷蛋白可降低其弹性，但脱除醇溶蛋白则相反。

图5 脱除不同溶解性内源蛋白质对早籼米粉糊化后流变学特性的影响Fig.5 Effects of removing different soluble endogenous proteins on rheological properties of gelatinized rice flour

2.6 脱除不同溶解性内源蛋白质对早籼米粉糊冻融稳定性的影响

早籼米粉及其依次脱除清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白样品糊化后的冻融稳定性如图6 所示。经过1、3、5 次冻融后，同一样品的析水率变化很小，但不同样品间的析水率具有显著性差异（P<0.05）。以首次冻融后的数据进行对比分析：与RF 相比，RFAlb 的析水率无显著性差异（P>0.05），说明脱除清蛋白不影响早籼米粉糊化后的冻融稳定性；与RF 和RF-Alb 相比，RF-AGlo 的析水率分别提高72%和121%，说明脱除球蛋白会降低早籼米粉糊化后的冻融稳定性；与RF 和RF-AGlo 相比，RF-AGPro 的析水率分别提高107%和无显著性差异（P>0.05），说明脱除醇溶蛋白不影响早籼米粉糊化后的冻融稳定性；与RF 和RF-AGPro 相比，RF-AGPGlu 的析水率分别提高223%和56%，说明脱除谷蛋白会降低早籼米粉糊化后的冻融稳定性。因此，脱除球蛋白和谷蛋白可降低早籼米粉糊化后的冻融稳定性。

图6 脱除不同溶解性内源蛋白质对早籼米粉糊化后冻融稳定性的影响Fig.6 Effects of removing different soluble endogenous proteins on freeze-thaw stability of gelatinized rice flour

3 讨论与结论

根据上述研究结果，脱除不同溶解性内源蛋白质对早籼米粉理化性质的影响表现为：脱除清蛋白会抑制早籼米粉颗粒结构破裂并与水结合形成凝胶，也会抑制其糊化后回生；脱除球蛋白会促进早籼米粉溶解，提高其糊化温度，抑制其与水结合，提高其糊化后与水结合强度，降低其糊化后的弹性和冻融稳定性；脱除醇溶蛋白会在高温下促进早籼米粉膨胀，降低其糊化温度，促进其与水结合，降低其糊化后与水结合强度，提高其糊化后的弹性；脱除谷蛋白会促进早籼米粉溶解和在高温下膨胀，降低其糊化温度，促进其颗粒结构破裂但抑制其与水结合形成凝胶，促进其糊化后回生，降低其糊化后的弱结合水含量，提高其糊化后与水结合强度，降低其糊化后的弹性和冻融稳定性。

脱除不同溶解性内源蛋白质对早籼米粉理化性质的不同影响不能简单依据这些内源蛋白质的溶解特性解释。已有研究表明，大米淀粉的糊化特性受其直链淀粉结晶状态的影响[30]，而大米粉内源蛋白质会影响淀粉分子之间及直链淀粉与脂质的相互作用[31-32]，但不同溶解性大米粉内源蛋白质对淀粉分子结构及其与其他组分相互作用的影响尚未清楚。大米粉内源蛋白质可以形成可抑制大米粉颗粒吸水膨胀、使大米粉糊抗剪切的网络结构[33-36]，该作用很可能主要由含量最高的谷蛋白发挥，但本研究结果显示球蛋白和醇溶蛋白对早籼米粉糊的黏弹性具有不同的显著性影响。此外，已有研究发现，难溶于水的醇溶蛋白和谷蛋白经高温变性后，多肽链会舒展开，能提高其水溶性[37]。因此，不同溶解性内源蛋白质对早籼米粉理化性质的不同影响还需从其与早籼米粉其他内源组分在水热处理过程中的相互作用变化层面进行深入的研究。本研究工作为今后深入研究提供了线索。

本文得到的研究结论是，脱除不同溶解性内源蛋白质对早籼米粉的溶解度、膨胀度、成糊特性及其糊化后的水分结合状态、流变学特性和冻融稳定性具有差异化显著性影响。该研究工作为利用不同溶解性内源蛋白质调控早籼米粉理化性质进而提高早籼米粉制品品质提供了依据。