平菇发酵培养料制备过程中黄曲霉毒素降解变化分析

崔 筱，胡素娟，刘 芹，吴 杰，师子文，张玉亭，孔维丽

（河南省农业科学院食用菌研究所 郑州 450002）

玉米芯是黄淮海地区栽培平菇的主要原料，秋季收获后的玉米芯存放不当易产生黄曲霉毒素。黄曲霉毒素（aflatoxins，AFT）是一组由曲霉属（Aspergillus）的一些霉菌产生的具有强毒性和致癌性的次级真菌代谢产物[1-3]。据统计，曲霉属中有28个种的霉菌可产生黄曲霉毒素，其中最重要及最广为人知是黄曲霉（A.flavus）、寄生曲霉（A.parasiti-cus）和红绶曲霉（A.nomius）[4]。目前已分离鉴定出20 余种黄曲霉毒素异构体，其中最常见的包括B1、B2、G1、G2、M1、M2。

黄曲霉毒素具有稳定的结构，通过物理（臭氧、微波、高压、紫外照射、吸附剂等）或化学方法（碱处理法、氧化法等）仅能降低黄曲霉毒素的含量，很难将其完全去除。熟料栽培的金针菇菌渣中检测出黄曲霉毒素，其残留影响了食用菌菌渣饲料化及基质化的应用[5]。生物降解法是利用微生物产生的次级代谢产物或者所分泌的酶降解黄曲霉毒素，该方法由于其反应条件温和、底物专一性强、不易破坏营养成分等特点成为了近几年研究的热点[6]。目前，国内外已发现多种细菌、真菌能够降解黄曲霉毒素。孙然然[7]从土壤中筛选分离出一株纤维菌属（Cellulosimicrobium）的芬氏纤维微菌（C.funkei），该菌株降解黄曲霉毒素B1 的能力可达到94.16%。Risa 等[8]发现，红球菌属（Rhodococcus）的红平红球菌（R.erythropolis）NI1 和紫红红球菌（R.rhodochrous）NI2 菌株对黄曲霉毒素B1 的降解率可分别达到80% 和84%。Risa 等[8]发现，红球菌属的R.erythropolis可有效降解黄曲霉毒素B1。Eshelli等[9]发现，链霉菌属（Streptomyces）的S.lividansTK24 和S.aureofaciensATCC10762 对AFB1 的降解率分别为86%和88%。于丽娜等[10]发现，假单胞菌属（Pseudomonas）的M8 菌株可降解黄曲霉毒素B1。Akocak 等[11]发现，荧光假单胞菌（P.fluorescens）PB27 对黄曲霉菌丝生长和孢子萌发具有抑制效果。刘长宇[12]研究发现藤黄单胞菌属（Luteimonas）的菌株L.sp.CW574 对AFB1 的降解率可达到67.0%。李俊霞等[13]发现寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）的嗜麦芽窄食单胞菌（S.maltophilia）对AFB1 的降解率达85.7%。Hormisch 等[14]发现分枝杆菌属（Mycobacterium）的M.fluoranthenivorans可有效去除黄曲霉毒素AFB1。宫小明等[15]研究表明，芽孢杆菌属（Bacillus）的枯草芽孢杆菌（B.subtilis）和地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）在抑制黄曲霉孢子的萌发、菌丝生长、分解毒素3 个方面都有显著作用。吉小凤等[16]从肉鸡肠道粪便中筛选到一株乳杆菌属脱毒菌株LAB-10，发现该菌株对AFB1的脱毒率达到63.4%。Line 等[17]通过C-14 标记黄曲霉毒素B1 来追踪黄杆菌属（Flavobacterium）的橙色黄杆菌（F.aurantiacum）对其降解的情况，发现该菌的活细胞和死细胞都可以吸收一定量的黄曲霉毒素。邹盼盼等[18]发现类芽胞杆菌属（Paenibacillus）的饲料类芽孢杆菌（P.pabuli）E1 菌株有高效降解黄曲霉毒素的能力。李平[19]发现拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis）的菌株海洋拟诺卡氏菌N.sp.MA03有高效抑制黄曲霉毒素合成的能力。Biernasiak等[20]研究发现酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）具有降解AFB 的能力，在大麦、小麦和玉米粉的混合发酵试验中，酿酒酵母菌能有效地降低AFB1、B2、G1 和G2 的含量，降解率达到30%以上。施翠娥等[21]采用氮离子注入黑曲霉（A.niger）后获得一株黑曲霉突变株90A，发现其可以抑制合成或降解粮油作物中的黄曲霉毒素。Liu 等[22]利用假蜜环菌属（Armillariella）的发光假密环菌（A.tabescens）E-20 的提取液可使样品中的AFB1 含量减少80%。Wang 等[23]研究发现，原毛平革菌属（Phanerochaete）的乳白原毛平革菌（P.sordida）YK-624 菌株可降解黄曲霉毒素B1。Motomura 等[24]发现，侧耳属（Pleurotus）的糙皮侧耳（P.ostreatus）其发酵液具有降解黄曲霉毒素的功效。Das 等[25]利用侧耳属的平菇发酵液降解玉米秸秆中的AFB1。

前期研究表明，在平菇发酵料制备过程中，变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）等大量的微生物参与其中，发酵微生物在不同阶段基因丰度此消彼长，将物料分解成容易被平菇菌丝吸收的小分子营养物质[26]。这些菌群是否含有能够降解玉米芯中的黄曲霉毒素的菌类，黄曲霉毒素含量是否变化尚未有分析报道。鉴于此，笔者利用前期以玉米芯为原料发酵制备平菇培养料进行的宏基因组和代谢组检测数据为基础，通过采用非度量多维尺度排序法（non-metric multidimensional scaling，NMDS）研究不同发酵阶段发酵料中微生物种群基因丰度变化情况，通过进一步分析不同阶段相关微生物基因丰度的变化与黄曲霉毒素含量的相关性，阐明发酵培养料制备过程中菌群变化与黄曲霉毒素合成和降解的相关规律，挖掘出平菇发酵培养料制备过程中合成、抑制/降解黄曲霉毒素的潜在菌群，为食用菌培养料的安全制备提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 发酵原料及配方 发酵原料按照玉米芯84%、麸皮10%、尿素1%、石灰5% 的比例混匀，含水量68%。玉米芯、麸皮、石灰和尿素购自新乡农贸市场。

1.1.2 试剂 LC-MC 级甲醇、水、甲酸、醋酸铵、FastDNA SPIN Kit for Soil（MP，USA）和AxyPrepDNA Purification Kit（AXYGEN，Inc.）购自索莱宝公司。

1.2 方法

试验于2018 年11 月在河南省新乡市进行。按照Kong 等[26]的发酵方法，将搅拌均匀的培养料堆叠成高60 cm、顶部宽80 cm、底部宽120 cm 的梯形堆，长度不限，每组培养料干料质量为250 kg，堆好后，用直径30 cm 的木棍从上往下打孔，孔间距为30 cm，试验进行10 d，从第3 天开始翻堆，每隔1 d 翻1 次堆，至发酵结束共翻堆4 次，每翻堆1 次取1 次样品。以建堆第1 天的培养料为对照（T1），另4 次取样分别标记为T2、T3、T4、T5。按照料堆形状分别从左中右、上中下9 个位点各取样1 kg，然后均匀混合为1 份样品[27]，平均分成6 份，−80℃保存，用于发酵料微生物基因丰度及黄曲霉毒素含量分析。参照刘皓皓等[28]对发酵培养料进行的代谢组学检测数据，测定黄曲霉毒素含量。采用Kong等[26]所做的发酵培养料宏基因组测定数据，对发酵料微生物进行分析。

1.3 数据分析

试验数据采用SPSS（version 20.0）进行Pearson相关性分析，采用单因素方差分析法（One-way ANOVA）比较不同发酵时期微生物多样性及黄曲霉毒素含量的差异性，用最小差异显著分析法（LSD）进行多重比较，试验结果用平均值表示。

2 结果与分析

2.1 不同发酵阶段的黄曲霉毒素含量、曲霉属相对基因丰度变化及相关性分析

以p<0.05 和VIP（variable importance in the projection）>1 为条件筛选出具有差异性表达的化合物，对在T1、T2、T3、T4、T5 时期检测到的黄曲霉毒素进行分析。结果如图1-A 所示，共检测到两类黄曲霉毒素，分别为AFM1、AFG2，且在T1 期含量均极显著低于T2 期，在T1 和T2 时期AFM1 和AFG2 峰面积分别为704 621.885、107 624.797 和2 271 682.524、694 248.663，而在T3、T4、T5 阶段未检测到黄曲霉毒素。采用NMDS 分析了不同发酵阶段曲霉属相对基因的丰度变化，结果如图1-B 所示，在T2 期，曲霉属相对基因丰度最高，为2.00%，T1期最低，为0.01%，随着发酵时间延长，在T3～T5期，曲霉属相对基因丰度极显著降低，分别为0.60%、0.30%和0.06%，表明发酵初期的升温过程有利于曲霉繁殖，导致黄曲霉毒素含量增加。

图1 不同发酵阶段黄曲霉毒素含量及曲霉属相对基因丰度Fig.1 Aflatoxin content and relative gene abundance of Aspergillus at different fermentation stages

为了探究黄曲霉毒素含量与曲霉属间的关系，对在T1、T2、T3、T4、T5 时期检测到的黄曲霉毒素含量与各阶段的曲霉属基因丰度进行Pearson 相关性分析。结果表明，AFM1 和AFG2 含量与曲霉属基因丰度呈显著正相关，相关系数分别为0.489、0.530（表1），说明曲霉属是合成黄曲霉毒素AFM1和AFG2 的种属。

表1 不同发酵阶段黄曲霉毒素含量与曲霉属基因相对丰度变化相关性分析Table 1 Correlation analysis between aflatoxin content and relative abundance changes of Aspergillus genes at different fermentation stages

2.2 不同发酵阶段发酵料中微生物种群基因丰度变化情况

为了确定发酵培养料制备过程中微生物种群的遗传信息，推测这些微生物菌群是否与降解黄曲霉毒素有关，对不同阶段的发酵料样品进行了宏基因组测序和分析研究。采用非度量多维尺度排序法分析了不同发酵阶段微生物种群的基因丰度变化。笔者将文献报道的抑制/降解黄曲霉毒素相关的菌群和本研究中相对丰度较高的优势属作为研究对象，结果表明，在本研究中，仅富集到纤维菌属、红球菌属、链霉菌属、假单胞菌属、分枝杆菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、黄杆菌属等细菌，并未检测到假密环菌属、原毛平革菌属、侧耳属等属的真菌（图2）。在属水平上，不同阶段有不同的优势属。在发酵前期（T1 期），不动杆菌属、假单胞菌属、鞘氨醇杆菌属、谷氨酰胺杆菌属、嗜麦芽窄食单胞菌属丰度较高，在嗜热阶段（T2、T3 期），芽孢杆菌属、不动杆菌属、假黄色单胞菌属、类芽胞杆菌属、直丝菌属丰度较高；在发酵后期（T4、T5 期），假黄色单胞菌属、藤黄单胞菌属、高温双岐菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属等丰度较高。其中，不动杆菌属在T1、T2、T3 期丰度较高，且在T2 期达到最高（37.18%），高于发酵料制备整个时期的所有菌群，但到T4、T5期丰度分别降至0.25%、0.20%；假单胞菌属在发酵前期丰度较高（11.48%），T2 期降至最低（0.32%），在T3、T4、T5 期丰度提高，分别为1.65%、2.92%、2.66%；假黄色单胞菌属在T1、T2 阶段丰度较低，在T3、T4、T5 期丰度逐渐提高，在T5 期达到最高（13.59%）；类芽胞杆菌属、芽孢杆菌属在整个时期丰度一直较高，在嗜热阶段（T3 期）均为最高（3.76%、12.62%）（表2）。

表2 不同发酵阶段基于属水平的种群基因丰度Table 2 Communities gene abundance based on the genus level at different fermentation stages %

图2 不同发酵阶段基于属水平的微生物种群结构变化Fig.2 Microbial communities changes at the genus level at the different fermentation stages

2.3 黄曲霉毒素含量与不同阶段相关微生物基因丰度变化的相关性分析

为了进一步探究黄曲霉毒素含量与优势菌群之间的关系，对在T1、T2、T3、T4、T5 时期检测到的黄曲霉毒素含量与各阶段相对丰度较大的优势属基因丰度进行Pearson 相关性分析。由表3 可知，AFM1 含量与不动杆菌属、乳酸杆菌属均呈极显著正相关，相关系数分别为0.961、0.765；AFG2 含量与不动杆菌属、乳酸杆菌属均呈极显著正相关，相关系数分别为0.960、0.764；AFM1 和AFG2 含量与高温双岐菌属、假黄色单胞菌属、海洋拟诺卡氏菌属、类芽胞杆菌属、藤黄单胞菌属、直丝菌属、黄单胞菌属呈显著或极显著负相关。

表3不同生长时期黄曲霉毒素含量与微生物种群基因丰度的相关性分析Table 3 Correlation between aflatoxin content and gene abundance of microbial communities during different growth periods

对藤黄单胞菌属、嗜麦芽窄食单胞菌属、分枝杆菌属、芽孢杆菌属、类芽胞杆菌属等可有效去除黄曲霉毒素的种属进行进一步分析。结果见图3，在T1～T3 阶段，类芽孢杆菌属基因丰度呈增加趋势，在T4～T5 阶段，其基因丰度呈降低趋势，在T3期，基因丰度最高；T3～T5 阶段，假黄色单胞菌属、高温双岐菌属为优势属，且假黄色单胞菌属呈增加趋势，高温双岐菌属在T4 期基因丰度达到最高，在T5 期大幅下降，但是这几种属未见有降解黄曲霉毒素的报道。

图3 不同发酵阶段降解黄曲霉毒素相关属种群结构变化Fig.3 Histogram of communities changes of aflatoxin-related genera at different fermentation stages at the genus level

3 讨论与结论

笔者研究发现，在平菇发酵培养料制备过程中T1、T2、T3、T4、T5 时期共检测到两类黄曲霉毒素，分别为AFM1、AFG2，含量在发酵初期较高，发酵中后期检测含量为0。李亚莉等[29]接种产毒黄曲霉进行模拟普洱茶发酵试验，结果表明，发酵初期，黄曲霉在茶叶中生长较快，至发酵4 d 时，茶叶中已有大量的黄曲霉生长，但到发酵后期（8 d 以后）长势变弱，发酵终止时，未检测到黄曲霉毒素，与笔者的研究结果基本一致。

通过对黄曲霉毒素含量与不同阶段曲霉属基因相对丰度变化的相关性分析，表明AFM1 和AFG2 含量与曲霉属呈显著正相关，与不动杆菌属、乳酸杆菌属呈极显著正相关；与高温双岐菌属、假黄色单胞菌属、海洋拟诺卡氏菌属、类芽胞杆菌属、藤黄单胞菌属、直丝菌属、黄单胞菌属呈极显著负相关，推测呈负相关的这些菌群可能与抑制/降解黄曲霉毒素AFM1、AFG2 有关。研究发现藤黄单胞菌属的Luteimona ssp.CW574、类芽胞杆菌属有高效地降解黄曲霉毒素的能力[12,18]，但高温双岐菌属、假黄色单胞菌属、直丝菌属、黄单胞菌属是否能降解黄曲霉毒素尚未见报道，可推测类芽胞杆菌属、藤黄单胞菌属是降解平菇发酵培养料制备过程中黄曲霉毒素AFM1 和AFG2 的主要菌群。

黄曲霉毒素的污染主要在温度高、湿度大、通风透气条件不良等条件下产生[29]，在平菇发酵培养料制备过程中，T2 期料温由30 ℃升至55 ℃，含水量68%，且在T2 期，曲霉属相对基因丰度最高，为2.00%，导致黄曲霉毒素含量增加。尽管在T1～T2期，存在类芽胞杆菌属、黄单胞菌属菌群，但由于其基因丰度较低，并未发挥作用。T3～T5 期，料温升至70 ℃左右，不利于黄曲霉菌群的繁殖，曲霉属相对基因丰度极显著降低，同时类芽胞杆菌属、藤黄单胞菌属、海洋拟诺卡氏菌属基因丰度均增加，藤黄单胞菌属为优势属，但海洋拟诺卡氏菌属基因丰度较低，这些菌群均具有降解黄曲霉毒素的功能，因此推测平菇发酵培养料发酵过程中藤黄单胞菌属和类芽胞杆菌属是主要的黄曲霉毒素降解菌。

综上所述，藤黄单胞菌属和类芽胞杆菌属是平菇发酵培养料发酵过程中降解黄曲霉毒素AFM1和AFG2 的主要降解菌，后续还需要进一步分离相关菌株进行验证。