葡萄酒酿酒酵母选育与非酿酒酵母混菌发酵研究进展

王 栋，梁进忠，刘玉杰，鞠 宝

（烟台大学,山东烟台 264003）

葡萄酒即以葡萄作为原料，利用微生物发酵酿造生产出的果酒，大多数葡萄酒的酒精度在9%～15 %（ABV）之间，某些酒精度高的特型葡萄酒酒精度能达到15%(ABV）以上，除了酒精外，葡萄酒中还具有许多对于人体有益的物质，比如含有多种维生素，其中维生素B 类的含量最为丰富，维生素B 类物质可以缓解人体疲劳，促进人体内的新陈代谢，同时对于贫血也有一定的治疗作用；葡萄酒中含有的有机酸，比如苹果酸、酒石酸等可以帮助调节身体酸碱平衡，同时具有一定的助消化作用；葡萄酒中还含有酚类物质，单宁是其中最重要的一种，它是葡萄酒中涩味的主要来源，单宁主要由葡萄中的葡萄皮和葡萄籽发酵而来，也有一些是葡萄酒萃取橡木桶中的单宁，单宁具有预防心脑血管疾病、抗氧化的作用，葡萄酒中含有的白藜芦醇也是一种可以预防心脑血管疾病的物质，是一种具有天然抗癌效果的物质，能够调控细胞的多种生长途径，对多种肿瘤都有抑制作用[1]，长期适度饮用葡萄酒，可以促进人的食欲、减轻机体老化、预防心脑血管疾病、抗癌、美容养颜等。

目前评价一款葡萄酒优劣的感官分析方法是依据《葡萄酒、果酒通用分析方法》（GB/T 15038—2006）附录F 中葡萄酒评分细则进行评价，主要从外观、香气、滋味和典型性方面做出判断。葡萄酒中的甘油、挥发酸、花青素、残糖以及白藜芦醇含量也是判断一款葡萄酒优劣的重要指标。

葡萄酒优劣主要由三个方面决定，一是原材料，也就是葡萄的品质如何，酿造葡萄酒需要选用酿酒葡萄，对比食用葡萄，酿酒葡萄果实小，果皮厚，果肉少，不适合直接食用，但其果汁多，糖分含量多，种子比较大，含有更多的单宁，适合进行发酵，每种酿酒葡萄酿造出的酒的风味也不同，同时还受果实生长状况的影响；第二个方面是酿造工艺，酿造工艺的不同也会决定葡萄酒的风味，例如浸皮时间长短、发酵温度、发酵时机、陈酿时间等，都会对酒的品质造成影响；第三个方面是酿酒酵母，酿酒酵母在葡萄酒发酵过程中担任最重要的“工具”，不仅是将葡萄中的糖类物质转化为酒精，同时其产生的各种代谢物也是葡萄酒中风味的重要来源。在这三个方面中，酿酒酵母又是其中最重要的，所以筛选出优良酿酒酵母菌种就显得极为重要。

1 酿酒酵母

1.1 酵母菌简介

酵母菌是单细胞真核微生物的总称，其细胞形态多为球形、卵圆形、椭圆形或腊肠形[2]；菌落形态大多数呈乳白色奶油状，表面光滑，质地均匀，还有少量菌种呈红色或黑色；酵母菌繁殖方式有芽殖、裂殖和子囊孢子，大多数为2 倍体，少数为单倍体，比如八孢裂殖酵母，虽然存在2倍体时期，但2倍体时期极短。

酵母菌在自然界分布广泛，在含糖量高的环境中容易被发现，尤其是在葡萄园中，葡萄的果皮、叶、根圈和土壤最容易找到野生酵母菌[3]。除了自然环境中能够发现的酵母菌，在人类活动的相关场所也可以发现不同种的酵母菌，比如葡萄酒工厂、面包厂和乳制品厂等，这些酵母菌有的经过与周围环境的不断适应，已经发生了一些性状上的改变[4]。

酵母菌在发酵时产生的各种代谢产物在一定程度上会对葡萄酒的香气产生影响，有的是增加香气，使香气更复杂，有的则产生负面影响，比如克勒式酵母会造成果酒超量产酸，毕赤酵母属会产生菌膜及过量乙醛，汉逊酵母属会产生过量的乙酸及其酯类，产生有毒物质[5]。

1.2 优良酿酒酵母

酿酒酵母是葡萄酒酿造过程中贯穿始终的主要酵母[6]，在发酵过程中非酿酒微生物会随着发酵的进行，酒精度的逐渐升高而减少直至消失，酿酒酵母会逐渐增加直到发酵终止，优良的酿酒酵母应该有以下几个特点：

（1）发酵速度快且稳定，比如周桂珍等[7]从贺兰山东麓分离筛选出的两株酵母菌G4，H3 发酵起酵速度快，发酵产生的葡萄酒酒精度高，具有用于工业发酵的潜力。

（2）具有很好的抗逆性，能够在高糖、高酒精度、低pH 环境下生长，目前葡萄酒发酵液中一般是通过SO2杀灭有害菌，所以优良的酿酒酵母还需要有一定的抗SO2能力，比如Liu 等[8]从蜂蜜中分离出6种抗逆性强的菌株可作为商业菌株开发利用。

（3）要有一定的嗜杀能力，能够致死发酵液中的有害菌，Fatima 等[9]从阿尔及利亚土壤中分离出的克鲁维毕赤酵母，能够分泌一种新型的嗜杀蛋白（Pkkp），该蛋白能杀灭食品和饮料中的多种有害酵母。

（4）能够发酵产生独特的令人愉悦的香气，程仕伟等[10]从新疆霞多丽葡萄自然发酵醪中分离筛选出本土酵母XXF3，其发酵产生的苯乙醇是商业菌RHST的7倍多，具有工业化发酵应用的潜力钉；闫兴敏等[11]探究了13 株本土酿酒酵母的产香气物质的能力，XM12葡萄酒风味最为纯净。

（5）发酵后葡萄酒的残糖含量、挥发酸以及葡萄酒的澄清度，吴启凤等[12]筛选出的两株酵母菌发酵性能都优于商业菌株LA-PE，可作为优良菌株用于开发当地水晶葡萄酒。

2 酿酒酵母的选育

优良酿酒酵母的选育分筛选和育种两个方面。菌株的初步筛选一般选用杜氏小管产气实验，挑选出产气迅速，产气量多的菌株，再通过测试菌株的耐受性复筛出耐受性优良的菌株。自然界中存在着多种野生酵母，但并不是所有的野生酵母都适合用来发酵葡萄酒，这就需要在菌株筛选的层面上更进一步，进行酵母菌的育种工作。随着时代的发展，科技的进步，酵母菌育种技术也在不断进步和发展，目前酵母菌育种的方法主要有自然育种，杂交育种、诱变育种、原生质体融合、基因工程育种、代谢工程育种，这些育种方法各有利弊，在育种时应根据实际条件合理运用，最大程度发挥出方法的优势，还应将这些方法有机结合起来，通过多种方法培育出具有各方面优良性状的理想菌株[13-16]。

2.1 自然选育

在自然界中不加以人工干预挑选出具有优良性状菌株的过程叫做自然选育，自然界存在的野生菌株发酵性能大多数都不够满足发酵工业的需求，但也有少数突变株具有优良的发酵特性，Li 等[17]通过自然选育，从葡萄汁中分离出32 株野生酵母菌，经过发酵测试，仅有一株发酵特性较好，耐受性强，自然选育是有一定几率获取到优良野生酿酒酵母的。自然选育的优点在于操作简单，菌种容易获取，且获得的野生菌株传代培养不易发生突变，缺点在于处理的菌种数目巨大，效率低，获得的菌株无法保证所有的性状都符合工业生产需要。

2.2 诱变育种

诱变育种又分为物理诱变、化学诱变以及生物诱变，是通过利用诱变剂作用于酵母菌使酵母菌基因突变的概率大大增加，然后进行筛选从而获得优良发酵性状的新型酵母菌株的方法。

2.2.1 物理诱变

物理诱变最常用的方法是使用紫外、微波、超声波以及一些能够引起电离辐射的射线或快中子等物理诱变剂作用于酵母菌，这些诱变剂会提高酵母菌DNA 碱基的错配率，从而造成酵母菌的基因突变[18]。王犁烨等[19]通过紫外诱变的方法对菌株Y6 进行诱变，筛选获得菌株Y6-5 在产酒精以及产酸的能力上要明显高于Y6 菌株。物理诱变具有无污染、变异率高、易于操作等优点，但有些物理诱变方法具有局限性，需要相应的专业设备和专业人员，具有一定的危险性。

2.2.2 化学诱变

化学诱变是利用一些化学药品作为诱变剂作用于酵母菌，使酵母菌基因突变几率大大增加的方法，烷化剂、核酸碱基类似物、羟胺、吖啶色素等都是常用的诱变剂。倪晓丰等[20]以BY23 为出发菌株，利用硫酸二乙酯（DES）进行化学诱变，筛选获得高核糖核酸酿酒酵母BY23-195，其胞内RNA 含量达到16.01%，较优化前有了明显提高；梁裕崴[21]通过对获得的野生菌株A21 进行化学诱变，筛选获得的菌种Y42 在酒精耐受性面有显著提高；Su 等[22]使用EMS 诱变技术筛选所得到的菌株分别命名为EMS39-20 和W303-1A-20，突变株与出发菌株W303-1A-20 相比，EMS39-20 使异丁醇滴度提高了49.9 %。化学诱变剂诱变与物理诱变一样具有简便快捷的优点，并且诱变剂诱变不需要大型设备及专业人员，相比较而言更加经济，但是大多数的化学诱变剂都有使人体致癌的风险，需要做好防护措施。

2.2.3 ARTP诱变

除了这些常规的诱变方法外，近几年还出现了新型的诱变方式，常压室温等离子诱变（ARTP），ARTP 通过产生的高浓度活性离子使酵母菌中DNA 单链或双链发生断裂，造成DNA 损伤，DNA损伤的细胞会启动应急修复机制，引起细胞的基因突变[23]。王犁烨等[24]通过ARTP 诱变方法作用于从葡萄表面分离筛选出的菌株Y6，获得的诱变后菌株Y6-8 在产酒精和产酸能力上都明显优于原始菌株Y6；王伟雄等[25]利用ARTP 诱变方法作用于从葡萄皮表面分离筛选出的野生马克斯克鲁维酵母菌株YK，获得的突变株YK-1、YK-29 产酒精能力比原始菌株提高149 %、169 %；杨耀[26]利用ARTP 诱变作用于出发菌株1048，获得的突变株SCZ40 产GSH 含量比出发菌株提高了32.74%；Wang 等[27]利用酿酒酵母通过ARTP 随机突变和适应性进化，建立耐381 g/L 蔗糖的突变体库，筛选最佳菌株，乙醇收率提高20.48 %，蔗糖利用率达到81.64 %。ARTP 是近几年来人们研究出的育种方式，相比其他诱变方法具有对人体无毒无害的优点，操作也并不复杂，在酿酒酵母育种方面得到越来越多的应用，人们对于这种方法的研究也越来越重视。

2.3 杂交育种

杂交育种的原理是酵母菌的基因重组，能够将多个品种的性状整合起来，然后定向筛选出人们所需要的具有优良性状的理想杂合子。

Pérez 等[28]使用非转基因技术（稀有交配）生成了种内和种间杂交种，其中将非酿酒酵母菌株与酿酒酵母进行杂交，筛选的后代携带有酿酒酵母线粒体的杂交种相比于原始菌株表现出更好的发酵能力，而携带非葡萄酒菌株线粒体的杂交种降低了乙醇水平，但产生甘油、2,3-丁二醇和有机酸的量有了明显增加。此外，与原始酿酒酵母相比，后代杂交种都在不同程度上产生了水果香气和花香。吴宇等[29]通过将酿酒酵母特定基因谷氨酰胺合成酶基因GLN1 插入到载体pESC-URA 上，再将载体导入到原始酵母BY4741 中，构建出了重组酵母YEA9，对重组酵母糠醛耐受性及发酵性能进行测定，最终表明重组酵母能够耐受更高浓度的糠醛，酒精发酵效率比原始酵母有显著提高。

杂交育种的优点是能够将不同亲本的性状整合到一起，缺点是操作难度较大，技术要求高。

2.4 原生质体育种

原生质体育种是将两株不同的亲代菌株，通过脱壁处理，在高渗条件下利用促融剂促融，使两株细胞融合在一起，在细胞质相互融合时，细胞间会进行基因重组，从而获得同时具有两种亲本性状的新型菌株。徐奎栋[30]将增香性能优越的酿酒酵母WLS21 和显著降低代谢物中乙醇含量的嗜乙醇假丝酵母SJ03 为出发菌株，利用原生质体融合的方法得到融合菌株R6，其同时具有两种亲本优异的性状；Sharma 等[31]通过原生质体融合的方法将己糖发酵菌酿酒酵母与发酵木糖的树干毕赤酵母作为两个亲本，融合得到的融合子菌株利用木糖的效率要明显高于亲代。利用原生质体育种的优点在于可使基因重组的频率增高，不仅细胞核中的基因，还包括细胞质中的基因，能够将两亲本优良性状整合到一起，缺点是操作复杂、技术难度较高，需要亲本具有一定的优良性状。

2.5 基因工程育种

基因工程育种是将具有某种优良性状或是人们所需性状的外源基因片段，通过一定的手段导入到宿主细胞中，使外源基因能够在宿主细胞中表达并传代，从而获得具有优良目的性状的工程菌株。

Jeong 等[32]利用基因工程技术，开发出一种新型菌株，在阿拉伯糖和木糖存在的情况下允许同时消耗半乳糖醛酸，解决了五碳糖部分半乳糖醛酸的代谢瓶颈；耿娜[33]通过基因工程的方法在酿酒酵母中构建出对羟基苯甲酸的合成途径，并且对酿酒酵母中的莽草酸途径、磷酸戊糖途径、糖酵解途径3种途径进行改造，工程菌株相比原始菌株产量有了明显提高。基因工程最大的优点就是可以定向的对菌株进行改良，并且可以跨过种属间的差别，缺点是技术难度高，并且插入的外源基因有可能影响原始菌株的生长特性。

2.6 代谢工程育种

代谢工程是从细胞代谢层次对细胞进行定向优化，通过对细胞内遗传和调控过程进行优化，提高细胞产生人类所需目标产物的能力。代谢工程改造通常基于以下几个目标[34-37]：增强细胞对于多种底物利用的能力；提高细胞内产物合成能力；提高底物的利用转化率；使菌株更加健壮等。Xu 等[38]利用代谢工程技术，使酿酒酵母可以生产富马酸（FA），通过删除FUM1基因获得的工程酿酒酵母菌株可以产生浓度为610 mg/L±31 mg/L 的FA；曲丽莎[39]以酿酒酵母CEN.PK2-1C 为出发菌株，在胞内重构7-DHC 的合成途径，利用代谢网络模型和CRISPRi 系统协调细胞生长和产物积累的关系，并进一步提高7-DHC 的合成量，最终获得了一株高产7-DHC 的菌株。代谢工程育种的优点在于其定向优化不会对原始菌株生长特性造成未知的影响，能够定向创造出人们所需要的工程菌株，缺点是操作难度较高，需掌握目的产物的代谢途径。

3 酿酒酵母鉴定方法

3.1 传统鉴定

通过自然选育获得的野生酵母菌通常需要确定其种属，传统的酵母菌鉴别方法是通过测定酵母菌的各种理化性质如可利用的碳源种类、可利用的氮源种类、能否在特定筛选培养基上生长等，再通过观察菌株的形态学特征如菌体形状、菌落大小、菌落颜色等做出判断，同时酵母菌的繁殖方式也是酵母菌分类的重要依据。掌握一株野生菌株的理化性质、形态学特征及繁殖方式，再通过比对《酵母菌的特征和鉴定手册》和《微生物分类学》，确定酵母菌的种属。这种传统的鉴定菌种的方法优点是简单易行，缺点是工作繁琐、处理量大、周期长且重复性差[40-42]。随着科技的进步，时代的发展，更多新型的菌株鉴定方法正逐渐取代传统的鉴定方法。

3.2 WL培养基

利用WL 营养琼脂鉴定培养基进行菌种鉴定，适合作为酵母菌的初步鉴定，通过观察酵母菌在培养基上生长的菌落形态来判定酵母菌的种类。Cavazza 等[43]通过研究发现，酿酒酵母菌不同菌种在WL 营养琼脂鉴定培养基上生长的菌落颜色和形态不同，通过分辨菌落形态可以将在葡萄酒自然发酵过程中出现的大多数典型的酵母菌区分开；王志恒等[44]使用WL 营养琼脂培养基进行初步分类，再结合26S rDNA D1/D2 区测序分析，共鉴定出5种酵母菌；薛军侠等[45]通过一系列的生理生化实验，26S rRNA 测序，表明通过WL 培养基初步鉴定的菌种类型，与最终分析得出的菌种类型完全一致。优点是操作简单，缺点是只能大致区分葡萄酒中典型的酵母菌，需与其他鉴别方法联用。

3.3 核糖体DNA序列分析

核糖体DNA 序列分析是目前鉴别酵母菌种类最常用的方法，酵母菌核糖体具有4 种不同沉降系数的RNA 片段，分别是26S、18S、5.8S、5S，通过串联排列的方式在同一转录单位中，之间间隔着间隔区ITS。rRNA 结构既具有高度的保守性，其保守性反映了物种间存在的相关联系，又具有高变性，其高变性则反映了种间不同。目前用得最多的是大亚基上的26S rDNAD1/D2 区域序列，其优点在于长度适中，适合用于酿酒酵母的鉴定。冯涛等[46]通过采集不同地区土壤分离纯化出4 株酵母菌，通过26S rDNA D1/D2 区域序列比对及构建系统发育树分析，结果表明其中3 株为酿酒酵母，1 株异常威克汉逊酵母；陈秀秀等[47]将从蜂蜜中分离提取出的1 株野生酵母菌做26S rDNA 鉴定，确定其为酿酒酵母；李小坤[48]利用ARTP 技术处理原始菌株得到诱变后菌株Y17aM3-12，对其进行26S rDNA 测定，将测得的基因序列与数据库的序列进行同源性比较，结果表明诱变后菌株与Saccharomyces cerevisiaeNL9-9 同源性相同；El Dana 等[49]研究了西部半沙漠贝卡河谷4 个葡萄品种（卡里格南、西拉、格雷纳赫和阿斯瓦德卡雷什）的酵母菌多样性，通过26S rDNA鉴定出96株酿酒酵母。

除上述方法外，酿酒酵母现代分子鉴定的常用方法还有等位酶分析、线粒体DNA 限制性酶切分析、DNA 微卫星分析、巢式PCR 扩增、可溶性蛋白酶分析、显微傅里叶变换红外光谱分析等[50-55]。

4 非酿酒酵母与酿酒酵母混菌发酵

酿酒酵母在葡萄酒发酵担任主要角色，是负责将糖类转化为酒精的主要工具，目前市面上的商业菌株普遍具有发酵平稳、发酵速度快、酒精产率高等优点，但使用商业菌株进行葡萄酒的发酵不免会造成葡萄酒组成单调、香气单一等问题，随着人们对葡萄酒发酵过程的深入研究，人们对非酿酒酵母的研究越来越深入。

非酿酒酵母虽然在酒精产率、发酵特性方面不如酿酒酵母，但有些非酿酒酵母能够赋予葡萄酒独特的香气及口感。目前在葡萄酒领域研究最多的非酿酒酵母属有孢圆酵母属、有孢汉逊酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、美奇酵母属、克鲁维酵母属[56-61]等，周洪江等[62]以贵人香葡萄为原料，利用3 种商业化非酿酒酵母（戴尔有孢圆酵母、美极梅氏酵母和耐热克鲁维酵母）与酿酒酵母混合发酵酿制白葡萄酒，与单一酿酒酵母发酵的白葡萄酒作比较，发现非酿酒酵母与酿酒酵母混合发酵对提升葡萄酒香气有积极作用；罗来庆等[63]利用毕赤克鲁维酵母HSX-5、长孢洛德酵母MNS-6 和戴尔有孢圆酵母YQX-8 与酿酒酵母AWRI 796 混合发酵赤霞珠葡萄酒，通过气相色谱测定最终葡萄酒中的挥发性物质，表明混菌发酵液中含有的香气物质种类更丰富，含量更高；刘晓燕等[64]选用2种商业非酿酒酵母（编号为CT10、PL09）分别与3 种商业酿酒酵母（编号为MST、CEC01、F33）以1∶1 混合比例发酵赤霞珠，测量得到的干红葡萄酒，发现混菌发酵有助于提高葡萄酒的品质。

5 问题与展望

目前制约我国葡萄酒产业发展的重要因素是缺少优秀的酿酒酵母，从全世界葡萄酒产业的发展看，葡萄的产量、葡萄酒的产量都呈现下滑的趋势，这可能与全球新冠疫情的影响有关。我国的葡萄产量平稳，面对庞大的消费人群，为迎合不同的消费群体，不同葡萄酒口味、香味的差异可能就显得尤为重要。不同种葡萄发酵产生的葡萄酒口味不同，不同酵母菌发酵的同种葡萄生产的葡萄酒风味也存在差异。我国目前大部分商业用酿酒酵母还都依赖于进口，造成我国葡萄酒产业直接进口发酵完成的原酒，只有少量酒厂进行自发酵，不利于我国葡萄酒产业的发展。缺少本土的酿酒酵母，不利于形成我国葡萄酒特有的风味，形成自己的葡萄酒特色。

我国葡萄产业发达，酵母菌种类多，缺少的是从数量庞大的野生酵母中筛选出优秀的酿酒酵母，合理的筛选方法、正确的育种手段就显得尤为重要。目前我国的学者在酿酒酵母选育这一方面也越来越重视，西北农林科技大学的刘延琳教授及其团队筛选出了两株本土酿酒酵母，其“中国本土葡萄酒酵母种质资源创新和产业化应用”项目通过了成果鉴定，标志着我国也有了自己的本土成熟酿酒酵母。同时，非酿酒酵母在葡萄酒发酵过程中的作用也不应被忽视，非酿酒酵母对于葡萄酒发酵过程中香气的产生有着功不可没的作用，酿酒酵母与非酿酒酵母的共同发酵扩宽了生产具有独特香气葡萄酒的可能性，挑选合适酿酒酵母与非酿酒酵母共同发酵葡萄酒具有重要意义。