基于网络药理学和分子对接探究薰衣草治疗睡眠障碍的作用机制

毛小文，顾志荣，杨浩，苏晓艳，王园园，葛斌*

（1.甘肃中医药大学 药学院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省人民医院 药剂科，甘肃 兰州 730000；3.甘肃省睡眠医学中心，甘肃 兰州 730000）

睡眠障碍（Sleep disorders， SD）是由各种原因引起患者睡眠和觉醒正常节律交替性紊乱的一种现象［1］，常表现为疲劳乏力、头昏、精神不振、甚至偏执的倾向，严重者会产生焦虑、抑郁以及精神障碍［2］。《2022中国国民健康睡眠白皮书》显示，近3/4的人曾有睡眠困扰，入睡困难成为头号难题；其中，未成年人平均睡眠时长仅7 h；25 ～ 60岁之间的人群，随着年龄的增长睡眠时长逐渐减少，睡眠时长超过6 h的占比也逐渐降低；睡眠质量类疾病包括嗜睡症、发作性睡病、睡眠障碍等，但有相当多的人得不到合理的诊断和治疗［3］。

据《中华本草·维吾尔药卷》记载，薰衣草为唇形科植物薰衣草（Lavandula angustifoliaMill.）的干燥地上部分，又称为香草、灵香草、拉文德等，主产于新疆，其中伊犁地区的狭叶薰衣草以其得天独厚的自然条件、悠久的栽培历史、优良的精油产量为人们所熟知，伊犁地区也是我国薰衣草的最大产区，有“中国的薰衣草之乡”的美誉。薰衣草味辛，性凉，具有清热解毒，散风止痒之功效，常用于治疗头痛、头晕、口舌生疮、水火烫伤等。薰衣草含有黄酮、多酚、鞣质、甾体、香豆素、有机酸及挥发油等多种化学成分［4-6］，其精油以醇类、酯类及萜类为主，主要包含芳樟醇、薰衣草醇、乙酸芳樟酯、乙酸薰衣草酯、桉油精及萜品烯-4-醇等［7］。现代药理研究证实，薰衣草及其精油除了具有抗抑郁［8-9］、抗焦虑［10-11］、抗惊厥、镇静催眠和抗炎［12］作用之外，还对治疗疼痛［13］、偏头痛和癫痫等［14-15］疗效较好，且不会对器官和组织结构造成病理后果［16］。目前，薰衣草及其精油改善睡眠障碍类疾病及其并发症的作用机理主要集中于胆碱能系统、组胺能系统和单胺类物质等［17］几个方面，尽管它们之间相互关系明确，但作用机制尚不完全清楚。因此，本研究以2021年世界中医药学会联合认证的《网络药理学评价方法指南》［18］为主要指导，以薰衣草的主要化学成分和SD靶标基因为研究对象，分析薰衣草主要活性成分及其治疗SD的潜在靶点，并采用分子对接技术对筛选出的主要活性成分和关键靶点进行结合活性验证，为薰衣草治疗SD的作用机制研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 活性成分筛选

检索CNKI和WOS数据库中与薰衣草相关的中、英文文献，同时收集已报道的薰衣草化学成分。利用中药系统药理学数据库和分析平台（Traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform， TCMSP）［19］（http://tcmspw.com/tcmsp.php），以口服生物利用度（Oral bioavailability， OB） ≥ 30%，且类药性（Drug-like， DL） ≥ 0.18为限制条件对化学成分进行药代动力学筛选。由于已报道薰衣草精油是治疗SD的主要药效物质基础，因此专门对其进行文献检索，对不满足上述条件但具有明显药效作用的精油中的化合物亦纳入。采用TCMSP进行靶点预测，采用PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获得已知化学成分的Canonical SMILES和2D Structure结构，分别导入SwissTargetPrediction（http://www.SwissTargetprediction.ch/）和PharmMapper（http://www.lilabecust.cn/pharmmapper/）分析平台预测各活性成分的靶点，运用UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）得到标准蛋白质靶点。

1.2 疾病相关基因查找

采用GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）、OMIM数据库（https://omim.org/）、TTD数据库（http://db.drblab.net/ttd/）及DrugBank数据库（http://www.drugbank.ca/）寻找治疗SD相关的潜在靶点，并在UniProt数据库得到对应疾病的靶点名称。

1.3 药物靶点-疾病相关基因交集

应用R语言（R version 4.1.2）提取“1.1”和“1.2”项中获得的活性成分-疾病交集靶点，作为薰衣草活性成分作用于SD的可能靶点，绘制Venn图。

1.4 网络模型的构建与分析

依据交集靶点建立“药物-化合物-靶点”网络，同时编辑属性（Type）文件，利用Cytoscape 3.9.1软件内置工具Analyze Network进行分析，通过参考拓扑学参数（度值、介度、紧密度等）对比分析核心靶点及活性成分在网络中的重要性，并导入Cytoscape 3.9.1软件中构建“药物-成分-靶点”可视化网络，得到薰衣草治疗SD的主要核心靶点及药效成分。

1.5 蛋白互作网络构建

通过STRING 11.5数据库（https://string-db.org/）构建交集靶点的靶标蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein interaction， PPI）网络，利用Cytoscape 3.9.1软件中的插件MCODE和cytoHubba（MCC算法）进行网络拓扑分析，建立PPI互作网络图。

1.6 通路富集分析

通过Enrichr数据库［20］（https://maayanlab.cloud/Enrichr/）对薰衣草治疗SD的核心靶基因进行基因生物学过程（Gene ontology， GO）富集分析、京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）通路分析。GO功能富集分析主要包括生物过程（Biological process， BP）、分子功能（Molecular function， MF）和细胞组成（Cellular component， CC），代谢通路包括WikiPathways、Bio-Carta、Reactome、KEGG等4种，分析其主要生物学过程与代谢通路，并进行富集分析。

1.7 成分-靶点分子对接验证

利用PubChem CID在其数据库内下载亚油酸乙酯、木犀草素、乙酸芳樟酯、熊果酸、芳樟醇小分子配体的2D结构，运用AutoDockTools 1.5.7软件对配体小分子进行加氢、检测扭转键、选择扭转键设置为配体等常规处理，并对靶点蛋白受体进行去水、加氢设置为受体，通过结合能（Affinity）对结合活性进行评价，采用PyMoL 3.8软件对3D结果进行可视化，获取薰衣草主要有效成分治疗SD的证据支持。

2 结果与分析

2.1 薰衣草潜在活性成分及靶点的获取

由CNKI和WOS数据库检索到薰衣草化学成分有426个，经筛选（OB ≥ 30%， DL ≥ 0.18）得到9个活性成分，另从文献中筛选出了4种用于治疗SD的主要有效成分［21-23］，将上述13个化学成分纳入到有效成分库（见表1）。通过PubChem获得成分结构式，导入到SwissTargetPrediction和PharmMapper数据库（设置Norm Fit ≥ 0.5）预测成分靶点，去除重复靶点后，共得到530个潜在作用靶点。

表1 薰衣草活性成分信息Tab.1 Information of active ingredients of lavender

2.2 疾病作用靶点筛选

通过检索GeneCards、OMIM、DrugBank和TTD数据库，经过滤、去重后，共获得SD的相关靶点2 749个。相关数据库单独检索靶点分别为GeneCards 1 886个、OMIM 851个、DrugBank 54个、TTD 11个，将4个数据库获得的SD基因取并集，结果见图1。

图1 SD相关基因靶点的Venn图Fig.1 Venn diagram of SD-related gene targets

2.3 药物-疾病共同靶点交集

通过检索疾病相关数据库，并收集得到与SD密切相关的靶点基因，将得到的靶点进行合并去重，得到2 749个SD相关靶点。使用R语言将潜在作用靶点与SD相关靶点取交集，并绘制Venn图，得到192个药物与疾病共有靶点，可作为薰衣草治疗SD的预测靶点库（见图2）。

图2 薰衣草靶W点与SD靶点Venn图Fig.2 Venn diagram of lavender W targets and SD targets

2.4 “中药-活性成分-共有靶点”网络

将共有靶点、薰衣草及活性成分导入Cytoscape 3.9.1软件得到“中药-活性成分-共有靶点”相互作用网络（见图3）。网络的拓扑学性质，包括206个节点，829条相互作用的边，网络中度值（Degree）排名靠前的活性成分有亚油酸乙酯、木犀草素、亚麻酸乙酯、乙酸芳樟酯、熊果酸等，其中黄色为活性成分与SD共同作用的靶点，绿色为薰衣草活性成分，红色为薰衣草。

图3 薰衣草治疗SD的“中药-活性成分-共有靶点”网络Fig.3 Network of ＂TCM - active ingredients - common targets＂ of SD treated with lavender

2.5 PPI网络

将疾病与活性成分的交集靶点导入STRING 11.5数据库绘制PPI网络，网络共有148个节点，构成377个相互作用关系，见PPI网络图4A。网络中的节点代表靶点，节点越大、颜色越深则度值越大，即蛋白之间的关系越密切。最后利用Cytoscape 3.9.1软件中的MCODE插件对核心网络进行分析得到核心网络图4B，利用cytoHubba插件的MCC算法综合分析得到排名前10的hub基因见图4C和4D。

2.6 GO 富集分析

将192个基因输入Enrichr数据库，设置P＜0.01，去重后共得到分析结果1 136条，包括966个BP、126个MF和44个CC条目，选取排名前10的条目在Ontologies项绘制GO功能分析（见图5），相关度较高的GO注释见表2。结果显示，薰衣草治疗SD的作用靶点主要涉及的BP（图5A）为参与细胞增殖、迁移、凋亡，MAPK级联的正向调节、磷酸化的正向调节，顺行跨突触信号、突触后膜电位的调节、炎症反应等过程；MF（图5B）主要涉及GABA门控氯离子通道、酪氨酸激酶、跨膜受体蛋白激酶、G蛋白偶联受体、γ-氨基丁酸（GABA-A）受体、神经递质受体等的活性过程；CC（图5C）涉及质膜的组成、神经元投射、树突、GABA-A受体复合物、膜筏、细胞内的胞质内腔等，表明薰衣草从细胞、分子层面通过多靶点、多通路和多生物过程来治疗SD。

2.7 通路分析

将192个基因导入Enrichr数据库，在Pathways模块以P＜ 0.01为标准进行WikiPathways、BioCarta、Reactome、KEGG通路富集分析，共得到潜在作用靶点参与的通路880条（见图6），具体数据见表3。选取P值前10的信号通路进行分析，WikiPathways数据库（303条）主要涉及磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶（PI3K-Akt）、EGFR酪氨酸激酶抑制剂、胃泌素、婴儿猝死综合征［24］、叶酸代谢［25］、晚期糖基化终末产物/糖基化终末产物受体（AGE/RAGE）等，见图6A；BioCarta数据库（105条）主要涉及酪氨酸激酶2（ERBB2）的转导、活性氧（ROS）的心脏保护、P53、端粒（端粒酶、细胞衰老）、血管内皮生长因子（VEGF）等，见图6B；Reactome数据库（281条）主要涉及GPCR信号的转导与配体结合、胺配体结合受体、跨化学突触的传输、蛋白激酶C（PKC）和MAPK的胃泌素-CREB、核受体转录等，见图6C；KEGG数据库（191条）主要涉及神经活性受体-配体相互结合、癌症、钙、缺氧诱导因子1（HIF-1）、PI3K-Akt、5-羟色胺（5-HT）能突触、AGE-RAGE等通路。

表3 薰衣草治疗SD的KEGG通路富集数据Tab.3 Pathway enrichment data of SD treated by lavender

2.8 分子对接

为了进一步验证薰衣草对SD的治疗作用，将PPI网络中排名前10的hub基因经物种（Homo sapiens）、分辨率（小于2.5 Å）、蛋白构象序列、结晶pH（接近人的正常生理范围）等条件粗筛后得STAT3、MMP9、PTPN11、MAPK1、IL2，将其分别与亚油酸乙酯、木犀草素、乙酸芳樟酯、熊果酸、芳樟醇等5种活性成分利用AutoDockTools 1.5.7软件进行分子对接。结果显示，分子与核心靶点的平均结合能为-7.68 kcal/mol，最低结合能均小于-4.25 kcal/mol，表示配体与受体均可进行自发结合，小于-5.0 kcal/mol表示有较好的结合活性，小于-7.0 kcal/mol表示有强烈的结合活性［26］，所对应的结合能见表4。结果提示，薰衣草活性成分与靶点之间可能存在氢键连接、π-π共轭、疏水堆积等分子间结合力，这些相互作用为活性化合物与目标蛋白的结合提供了较强的结合力，活性成分与关键靶点氢键连接情况见图7。结果显示，熊果酸与各蛋白对接的结合自由能均小于-10 kcal/mol，表明熊果酸能够很好的匹配各蛋白的活性口袋，其次是亚油酸乙酯与MMP9的结合能为-9.33 kcal/mol（见表4）。

图7 部分活性成分与核心蛋白对接示意图Fig.7 Docking diagram between some active ingredients with core proteins

表4 关键活性成分与核心蛋白结合能Tab.4 Binding energy between key active ingredients and core proteins

3 讨论

3.1 薰衣草13种有效成分对SD的作用机理

已有研究对薰衣草治疗SD的作用机制尚未完全阐明。本研究筛选出了薰衣草的13种有效成分，预测得到了192个相互作用的潜在靶点，并通过“中药-活性成分-共有靶点”及PPI网络分析筛选得到亚油酸乙酯、木犀草素、乙酸芳樟酯、熊果酸及芳樟醇为薰衣草治疗SD的主要活性成分，STAT3、MMP9、PTPN11、MAPK1与IL2是薰衣草治疗SD的hub靶点，最后通过分子对接证实了潜在靶点与活性成分有较好的结合活性，为进一步揭示薰衣草治疗SD的作用机制提供了借鉴。

许多研究证实，薰衣草可通过呼吸、皮肤黏膜及口服进入人体［27］，通过吸收、渗透和扩散途径作用于下丘脑及大脑皮质等部位。本研究GO富集分析发现，薰衣草精油被吸入后将信号传递给嗅球，再经MAPK级联、磷酸化、细胞因子介导等多个途径对神经细胞的增殖和凋亡过程进行负调控传导，以增强神经元和树突的可塑性，进而增强神经递质受体的活性，调节突触后膜电位，使作用于丘脑下部、海马体及淋巴系统的细胞因子刺激大脑分泌5-HT、多巴胺和γ-氨基丁酸等神经递质［28-30］，达到调控SD的效果。此外，薰衣草通过抑制下丘脑分泌促肾上腺皮质激素释放因子，减少垂体前叶促肾上腺皮质激素的释放，使得肾上腺降低皮质醇的分泌，保护因皮质醇过高而损伤的海马体［31］，也可通过抑制STAT3的磷酸化，减轻小胶质细胞异常活化介导的神经炎症和神经源性损伤，从而缓解抑郁样行为［32］，以多生物过程对患者的生理和心理产生积极影响，消除焦虑、抑郁、烦闷等情绪，最终改善睡眠质量。

3.2 薰衣草与SD共有靶点的通路分析

KEGG和Reactome相关通路分析发现，神经活性受体-配体相结合可能与多种神经递质及其受体有关［33］，其中视紫红质样类属于G蛋白耦联受体，5-HT受体也包含其中，是调节神经活性的一条重要的代谢通路［34］，主要通过阻止中枢神经对5-HT的再吸收来提高神经突触间隙内的浓度，或提高突触后膜AMPA受体表面活性，改善突触可塑性从而产生抗抑郁、抗焦虑的作用［35］。WikiPathways和Reactome分析发现，PI3K-Akt信号通路与胰岛素、胃泌素［36］等激素分泌相关，通过促进胰岛β细胞分泌胰岛素降低血液中葡萄糖含量，缓解糖尿病及并发症SD的症状，而胃泌素信号通路可以通过调节胃窦及十二指肠黏膜G细胞分泌胃泌素，胰岛素的分泌同时也受胃泌素的调控［37］，胃泌素的升高既可增加胰岛素的摄糖量，也可使胃排空减慢，提升壁细胞分泌盐酸和主细胞分泌胃蛋白酶原，增加对营养成分的摄取，改善精神状态，达到治疗SD的作用。WikiPathways、BioCarta和KEGG通路分析发现，AGE/RAGE信号通路是糖尿病及并发症SD发生的重要分子机制，主要分子作用是体内AGE不断积累，使得RAGE引起STAT3、蛋白激酶C（PKC）、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）等多种信号通路激活氧化应激反应［38］，引起炎症导致神经细胞损伤，是抑郁症、焦虑症病理机制中的关键环节［39］，其常与钙离子信号通路中的MAPK1有关，受到miR-129-5p的负调控，使得MAPK1的表达降低，抑制海马体的炎症反应［40］，起到缓解抑郁和焦虑的作用。

本研究表明，薰衣草中亚油酸乙酯、木犀草素、乙酸芳樟酯、熊果酸及芳樟醇等有效成分可能作用于STAT3、MMP9、PTPN11、MAPK1与IL2等靶点，调节神经活性受体-配体相互结合、5-HT、PI3KAkt、AGE/RAGE、PKC、p38 MAPK等通路，通过抑制炎症、氧化应激、增殖和凋亡负调控等发挥治疗SD的作用，上述靶点与所对应的活性成分均展现出较好的亲和力，且结合位点均有稳定的氢键，构象稳定，有强烈的结合能力，进一步验证了本研究的预测。基于本研究结果，我们后续将对筛选出的主要活性成分、关键靶点及通路进行体内外实验验证，以深入揭示薰衣草治疗SD的作用机制。

4 结论

薰衣草可能通过熊果酸、亚油酸乙酯、木犀草素、乙酸芳樟酯等关键成分，作用于MMP9、PTPN11、MAPK1、IL2等靶点，通过调控神经活性受体-配体相互结合、5-HT、PI3K-Akt等信号通路，抑制神经炎症、氧化应激等发挥防治SD的作用，为后续研究及临床应用提供了一定参考。