不同叶色猴樟花青素含量与光合特性比较

张楠，韩浩章，张丽华，李素华，赵荣，王芳

（宿迁学院 生物与材料学院，江苏 宿迁 223800）

彩叶植物是指在环境因子及其内在遗传特性的影响下，叶片在一定时期内全部或部分呈现紫色、黄色、红色、橙色等颜色的植物种类［1］。彩叶植物组织和器官的颜色取决于花青素、叶绿素、类胡萝卜素的含量和分布，花青素的主要存在形式是花青素苷，花青素苷除了参与叶片呈色外，还有抗高光强、干旱、低温弱光、紫外线、盐碱胁迫、病虫害等功能。研究表明，在烟草（Nicotiana tabacumL.cv.Xanthi）中过量表达金鱼草（Antirrhinum majusL.）Rosea1基因可增强花青素苷的积累，明显提高植物抗旱能力［2］。在盐胁迫下，紫茎假俭草［Eremochloa ophiuroides（Munro.）Hack.］中花青素苷含量显著高于绿茎假俭草，花青素苷明显提高紫茎假俭草的抗盐能力［3］。紫色羽衣甘蓝（Brassica oleraceaL. var.acephalaf. tricolor）的花青素生物合成相关基因表达水平在低温处理下显著提高，其花青素苷含量是温室栽培条件下的50倍，表明花青素与植物抗低温能力有关［4］。花青素促进逆境条件下植物正常生长发育的机理研究一直倍受关注。

研究表明，花青素的吸收光谱与叶绿素的吸收光谱部分重叠［5］，能够吸收400 ～ 600 nm的可见光，并且多数花青素分布在叶片表面，具备光消减功能［6-7］；另外，光合作用中的过量激发能会伤害PSII的光学活性，植物主要通过非光化学猝灭、循环电子传递、梅勒反应和光呼吸的形式进行耗散［8］，而花青素能够增加热耗散的比例，最大可能减少PSII中的过剩激发能；再者，花青素具有抗氧化特性，非生物胁迫下的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）信号调控转录子（MYB/bHLH/WD40）能激活花青素生物合成基因的表达［9］，致使叶片花青素积累，花青素通过清除ROS降低氧化应激，保护植物免受生长抑制和细胞死亡的影响。低温条件下，缺乏花青素的叶片具有更多的内源ROS，而富含花青素的叶片氧化损伤水平降低，光合速率提高［10］，花青素及其中间产物比抗坏血酸等抗氧化物质具有更强的ROS清除能力［11］。然而，也有研究认为，花青素在光系统保护方面的光消减功能应该比抗氧化功能更重要［12］，逆境下植物花青素的积累还与激素代谢［13］、抗氧化物质代谢［11］、糖代谢［14］、次生物质代谢［15］等途径密切相关，不同植物积累花青素响应逆境胁迫的机理仍存在争议。

猴樟（Cinnamomun bodinieriLevl.）为樟科（Lauraceae）樟属（CinnamomunSchaeffer）常绿乔木，是中国重要的经济树种、绿化树种和林用树种，但部分品系在春季新梢生长过程中新叶叶绿素含量较低，花青素苷含量较高，形成呈色稳定的红叶、紫叶等表型，一直持续到6月中下旬，具有很高的观赏价值，但人们对猴樟春季叶色变化的机理并不清楚。基于此，本研究以春季新梢表现为绿叶、红叶、紫叶的不同叶色猴樟实生苗为材料，比较其功能叶色素含量、花青素合成相关基因表达量、光合作用参数和叶绿素荧光参数，以期为初步研究猴樟春季叶色变化的机理提供参考，为选育优良猴樟品种提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究所用的试验材料选自宿迁学院樟属植物栽培基地实生苗，根据当年新稍呈色特征分为绿叶、红叶和紫叶3个处理。于2019年4月扦插繁殖，2021年3月移栽至盆内，栽培土pH为8.17，电导率为1 352 μs·cm-1。2022年4月中旬，选择正常生长、长势一致的猴樟扦插苗为材料，苗高130 ± 5 cm，每处理选择5株种苗挂牌标记，选取种苗新梢同一部位处于成熟期的功能叶片进行检测。

1.2 试验方法

1.2.1 光合色素含量及花青素含量测定

猴樟叶片光合色素含量及花青素含量测定参考蔡庆生［16］的方法，5次重复。

选择少云的晴天上午，在9 ： 00 ～ 10 ： 30期间用光合作用测定仪（Li-6400，Li-Cor公司）对猴樟光合作用参数进行测定。所测定的光合作用参数包括净光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）、气孔导度（Gs）、胞间CO2浓度（Ci）、水分利用效率（WUE），5次重复。其中叶片水分利用效率计算公式如下：

1.2.3 叶绿素荧光参数测定

光合作用参数测定的同时进行叶绿素荧光参数测定。选取功能叶片，采用叶绿素荧光仪（Yaxin-1161G，北京雅欣理仪科技有限公司）进行初始荧光（Fo）、暗适应下最大荧光（Fm）、光适应下最大荧光（Fm'）及光适应下初始荧光（Fo'）等的测定。在此基础上，参考李运丽等［17］的方法，计算暗适应下PSⅡ最大光化学效率（Fv/Fm）、光适应下PSⅡ的最大量子产额（Fv'/Fm'）、光适应下PSⅡ的实际光化学效率（ΦPSⅡ）、光适应下的PSⅡ反应中心开放的比例（qP）和光适应下的非光化学猝灭（NPQ），5次重复，取平均值进行统计分析。

1.2.4 花青素合成相关基因表达量分析

根据猴樟转录组数据库信息，通过OFR finder和NCBI-BLAST在线工具筛选出猴樟叶片花青素合成相关的查尔酮合成酶基因（CbCHS）、查尔酮异构酶基因（CbCHI）、黄烷酮-3-羟化酶基因（CbF3H）、黄烷酮-3'-羟化酶基因（CbF3'H）、二氢黄酮醇4-还原酶基因（CbDFR）、花青素合成酶基因（CbANS）、类黄酮-3-O-葡糖基转移酶基因（CbUFGT）的CDS序列。利用NCBI的Primer-BLAST在线软件设计定量引物（表1，由北京擎科生物科技有限公司合成）。

表1 实时荧光定量PCR所用引物Tab.1 Primers used for real-time fluorescent quantitative PCR

以不同叶色猴樟种苗新梢功能叶片为材料，按照艾德莱生物科技公司的RN53-EASYspin Plus多糖多酚植物RNA快速提取试剂盒说明书进行RNA提取，使用超微量核酸蛋白测定仪（Nano600，上海嘉鹏科技有限公司）检测RNA浓度，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。cDNA合成根据反转录试剂盒EasyScript® One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix的说明书进行操作。

荧光定量PCR以CbActin1作为内参基因，按照全氏金PerferStart® Green qPCR SuperMix试剂盒配制反应体系，采用荧光定量 PCR仪（Q2000B，杭州朗基科学仪器有限公司）测定3种猴樟叶片花青素相关基因的相对表达量。

实时荧光定量PCR反应体系为20 μL体系，包括cDNA 1μL，2 × SYBR Premix Ex Taq II （Tli RNaseH Plus） 10 μL，上下游引物各0.4 μL，ddH2O 8.2 μL；反应程序为95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 40 s，40个循环；采用2-△△Ct法进行相对表达量的分析，确定3种猴樟花青素合成相关基因的表达水平。

结肠癌的发生是一个多因素、多阶段和多基因改变协同作用的过程，其发生的分子基础包括癌基因和抑癌基因的表达失调[18]。研究结肠癌的发病机制，如分子遗传学和生物学的改变，在将来有希望能够改善患者的预后。但是，不幸的是，大多数患者死于其转移性[19]。因此，研究结肠癌的发生和转移都尤为重要。

1.3 数据统计与处理

采用Microsoft Excel 2010进行色素含量、光合作用参数、叶绿素荧光参数和花青素合成相关基因表达量数据处理，采用SPSS 22.0进行数据统计，采用最小显著差数法（LSD）进行不同处理间的显著差异分析。

2 结果与分析

2.1 不同叶色猴樟光合色素和花青素含量差异分析

叶绿素、类胡萝卜素和花青素的含量差异促使叶片呈色，分别对绿叶、红叶、紫叶猴樟幼苗功能叶片叶绿素、类胡萝卜素和花青素含量进行测定。如表2所示，绿叶猴樟的叶绿素a、叶绿素b和叶绿素（a + b）含量最低，而红叶猴樟的最高，但差异不显著；紫叶猴樟的类胡萝卜素含量最高，但三者显著不差异；紫叶猴樟的花青素含量最高，绿叶猴樟的最低，紫叶猴樟和红叶猴樟的花青素含量分别是绿叶猴樟的134.24倍和49.80倍，差异显著（P＜ 0.05）。

表2 不同叶色猴樟叶片的光合色素和花青素含量Tab.2 Contents of photosynthetic pigments and anthocyanins of C. bodinieri seedlings with different leaf colors

2.2 不同叶色猴樟叶片光合作用参数差异分析

叶绿素、类胡萝卜素与光合作用密切相关，采用Li-6400光合作用测定仪对猴樟光合作用参数进行测定。如表3所示，红叶猴樟和紫叶猴樟的Pn、Gs、Tr均高于绿叶猴樟，而Ci和WUE均低于绿叶猴樟；紫叶猴樟和绿叶猴樟之间的Pn、Gs、Tr、Ci和WUE均存在显著差异（P＜ 0.05），红叶猴樟和绿叶猴樟之间的Pn、Gs、Ci和WUE存在显著差异（P＜ 0.05），紫叶猴樟和红叶猴樟之间的Pn、Gs、Ci差异不显著。

表3 不同叶色猴樟的光合作用参数Tab.3 Photosynthetic parameters of C. bodinieri seedlings with different leaf colors

2.3 不同叶色猴樟叶绿素荧光参数差异分析

光合色素以蛋白复合体的形式存在于叶绿体类囊体膜上，通过吸收和传递光能参与光合作用中的能量分配，采用Yaxin-1161G叶绿素荧光仪测定其Fo、Fm、Fm'及Fo'等荧光参数。如表4所示，红叶猴樟和紫色猴樟的Fo、Fm、NPQ、Fo'/Fm'均显著高于绿叶猴樟（P＜ 0.05），而qP和ΦPSⅡ均显著低于绿叶猴樟（P＜ 0.05），Fv/Fm差异不显著。紫叶猴樟的Fo、Fm、Fo'/Fm'、Fv/Fm和ΦPSⅡ均高于红叶猴樟，仅有Fo、Fm差异显著（P＜ 0.05）；NPQ、qP均低于红叶猴樟，但差异不显著。

表4 不同叶色猴樟的叶绿素荧光参数Tab. 4 Chlorophyll fluorescence parameters of C. bodinieri seedlings with different leaf colors

2.4 不同叶色猴樟花青素合成相关基因表达量分析

采用实时荧光定量PCR技术对不同叶色猴樟功能叶片花青素合成相关基因CbCHS、CbCHI、CbF3H、CbF3'H、CbDFR、CbANS、CbUFGT的相对表达量进行分析。如表5所示，紫叶猴樟叶片CbCHS的相对表达量显著高于其他两个处理（P＜0.05），分别是红叶猴樟和绿叶猴樟的1.82倍和2.22倍，红叶猴樟与绿叶猴樟差异不显著；CbCHI和CbF3H在3种猴樟叶片中的表达量差异不显著；红叶猴樟叶片CbF3'H的表达量最高，分别是绿叶猴樟和红叶猴樟的2.58倍和2.96倍，绿叶猴樟和紫叶猴樟之间差异不显著；紫叶猴樟叶片CbDFR表达量最高，分别是绿叶猴樟和紫叶猴樟的2.14和1.4倍，绿叶猴樟与红叶猴樟之间差异不显著；紫叶猴樟叶片CbANS的表达量最高，分别是红色猴樟和绿色猴樟的2.99和3.93倍，绿叶猴樟与红叶猴樟之间差异不显著；红叶和紫叶猴樟的CbUFGT表达量分别是绿叶猴樟的16.73和20.74倍，红叶猴樟与紫叶猴樟之间差异不显著。

表5 不同叶色猴樟花青素合成相关基因表达量Tab.5 Expression levels of genes related to anthocyanin synthesis in different leaf colors of C.bodinieri seedlings

3 讨论与结论

3.1 不同叶色猴樟光合特性的比较分析

植物叶片呈色主要归因于叶绿素、类胡萝卜素和花青素等色素的含量差异。在本实验结果中，紫叶猴樟和红叶猴樟的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素（a + b）和类胡萝卜素含量均与绿叶猴樟无明显差异，而花青素含量差异巨大，紫叶猴樟和红叶猴樟的叶片花青素含量分别是绿叶猴樟的134.24倍和49.80倍，由此可见，花青素含量是猴樟叶片呈现紫、红色的主要原因，与前人研究结论一致［1］。叶绿素、类胡萝卜素又是植物主要的光合色素，以蛋白复合体的形式存在于叶绿体内的类囊体膜上，通过吸收和传递光能参与光合作用中的能量分配，其含量变化与植物光合功能相关。从本试验结果来看，红叶猴樟和紫叶猴樟的Pn、Gs、Tr均高于绿叶猴樟，而Ci和WUE均低于绿叶猴樟，推测花青素对植物的气孔开关具有调控作用，致使紫叶猴樟、红叶猴樟对CO2的吸收和同化能力高于绿叶猴樟，这种调控作用可能与光系统保护有关［12］。春季气温较低，猴樟新梢上的叶片还没有完全发育成熟，叶绿素含量偏低，对低温、强光、盐碱等环境因子的抵抗能力较差［18］，花青素的积累能够通过光消减、提高抗氧化活性、消耗光系统中过多激发能等形式保护光系统，提高光合速率，提高植物抗逆性。

从光系统功能来看，红叶猴樟和紫叶猴樟的Fo、Fm、NPQ、Fo'/Fm'均显著高于绿叶猴樟，而qP和ΦPSⅡ均显著低于绿叶猴樟，Fv/Fm差异不显著。Fo是PSⅡ反应中心处于关闭时的初始荧光产量，光系统功能受损与叶绿素含量增加均会导致Fo升高［19］。Fm反映PSⅡ的电子传递最大值，Fv/Fm体现PSⅡ反应中心光能最大转换效率；qP反映光适应下光化学活性，NPQ表示PSⅡ吸收的光能中以热的形式耗散掉的部分，Fo'/Fm'反映光适应下PSⅡ反应中心原初光能捕获效率；ΦPSⅡ为部分PSⅡ反应中心关闭时，PSⅡ原初光能捕获效率，体现PSⅡ和PSI之间实际电子传递情况［16］。本试验中，紫叶、红叶猴樟的光合色素含量高于绿叶猴樟，因而暗适应下的Fo、Fm也高于绿叶猴樟；3种不同叶色猴樟种苗生长条件一致，因而Fv/Fm值差异不显著。但在光适应条件下，绿叶猴樟光系统可能受到了损伤，光合能力下降，气孔开度变小；而红叶猴樟和紫叶猴樟中积累了大量花青素，一方面通过吸收、反射、渗透调节等措施降低植物对强光的吸收［7］，另一方面通过自身或中间产物以及其诱导的抗氧化活性减少ROS对光系统的损伤［9］，其Fo'/Fm'高于绿叶猴樟。再者，花青素还能通过耗散过量激发能的形式保护光系统，导致NPQ高于绿叶猴樟［8，20］，qP和ΦPSⅡ均低于绿叶猴樟，花青素的积累致使NPQ提高的原理仍需进一步研究。

3.2 不同叶色猴樟花青素相关基因的表达量变化规律

植物体内不同花色苷所呈现的颜色存在差异，天竺葵素及其衍生物呈红色或橙色，矢车菊素及其衍生物主要呈砖红或洋紫色［21］。本试验中，所用的猴樟种苗叶片呈现红色和紫色，其花青素的合成可能是以苯丙氨酸作为前体物质合成4-香豆酰CoA，4-香豆酰CoA在CHS、CHI、F3H的作用下形成二氢黄烷酮，而后二氢黄烷酮在F3'H、DFR、ANS的催化下形成矢车菊素，或者直接在DFR、ANS的作用下形成天竺葵素，矢车菊素或天竺葵素再通过UFGT糖基化反应形成稳定的花青素苷［1］，因3种不同叶色猴樟中CbF3'H均有较高的表达量，推测矢车菊素可能是猴樟叶片呈色的关键色素类型。在我们的研究中，紫叶猴樟的CbDFR、CbANS和CbUFGT基因表达量显著高于绿叶猴樟，红叶猴樟的CbDFR、CbANS和CbUFGT基因表达量高于绿叶猴樟，其中仅有CbUFGT差异显著，因而推测CbDFR、CbANS和CbUFGT可能是猴樟叶片呈色的关键基因。

值得注意的是，红叶和紫叶猴樟的CbUFGT表达量远高于绿叶猴樟，红叶猴樟与紫叶猴樟之间差异不显著，CbUFGT一方面通过合成大量花青素促进猴樟叶片呈色，另一方面还能通过糖基化过程消耗大量的碳水化合物，以防止碳水化合物积累对光合作用的反馈调节，间接促进光合功能［6］，基于此，我们推测CbUFGT的糖基化可能对猴樟叶色的形成起重要作用。另有研究表明，植物体内ANS基因的表达水平与花青素的消光功能呈正相关，花青素的消光功能可能在光保护中发挥比抗氧化功能更重要的作用，花青素的抗氧化功能可能更依赖于中间产物［12］。在本实验中，紫叶猴樟的CbCHS表达量显著高于绿叶猴樟和红叶猴樟，红叶猴樟的CbF3'H表达量显著高于绿叶猴樟和紫叶猴樟，CHS能催化4-香豆酰CoA合成查尔酮，F3'H能催化二氢黄烷酮合成二氢槲皮素，推测中间产物查尔酮和二氢槲皮素的积累可能在猴樟耐受春季低温过程中起作用，其机理尚需进一步研究。

综上所述，猴樟在春季生长过程中，新梢叶片易受低温的影响而积累花青素，花青素是猴樟叶片呈紫、红色的主要色素；花青素积累能调控植物的气孔开关，并能通过加大激发能热耗散的形式保护光系统，致使紫、红叶猴樟的碳同化能力高于绿叶猴樟。依据不同叶色猴樟花青素合成相关基因表达量分析，推测矢车菊素可能是猴樟叶片呈色的关键色素类型，CbDFR、CbANS和CbUFGT可能是猴樟叶片呈色的关键基因，其中CbUFGT对猴樟叶色的形成尤其重要，花青素合成过程中的中间产物查尔酮和二氢槲皮素可能在猴樟耐受春季低温过程中起重要作用。