芸薹属异源六倍体CGMCC No.2553多类型再生植株的获得

张德双 张凤兰 徐家炳

（北京蔬菜研究中心，100097）

芸薹属异源六倍体CGMCC No.2553多类型再生植株的获得

张德双 张凤兰 徐家炳

（北京蔬菜研究中心，100097）

应用游离小孢子培养技术对兼具有A，B，C染色体组的芸薹属异源六倍体CGMCC No.2553（AABBCC，n= 27）材料进行游离小孢子培养。结果表明，供试材料具有胚胎发生能力，并获得DH再生植株。220份驯化后的再生植株定植于日光温室中自交留种，其中12株获得自交种子。分别将DH植株与3份大白菜品种正、反交授粉杂交，得到4份杂交种F1代。经田间植物学鉴定，获得的杂交种为真正的杂种。目前，4份杂交种的染色体组成、倍性、育性等正在研究中。所获得的DH植株为今后构建遗传图谱，标记和定位重要的基因等后续研究奠定了基础。

芸薹属异源六倍体CGMCC No.2553 游离小孢子培养 再生株 大白菜 杂种一代

在芸薹属作物中，3个二倍体基本种 （或原始种）分别是:芸薹（Brassica campestris，2n=20，AA）、甘蓝（Brassica oleracea，2n=18，CC）、黑芥（Brassica nigra，2n=16，BB）。由3个基本种衍生的3个异源四倍体（双二倍体）复合种(或次生种)分别是：甘蓝型 油 菜 （Brassica napus，2n=38，AACC）、 芥 菜（Brassica junceae，2n=36，AABB）和埃塞俄比亚芥（Brassica carinata，2n=34，BBCC）。芸薹属作物3个二倍体基本种和3个异源四倍体复合种之间的遗传关系已经研究得非常清楚。早在1935年，日本科学家就提出禹氏三角（U’triangle）表示它们之间的关系[1]。正确理解芸薹属不同种各单染色体组之间的关系，不仅有助于解释芸薹属各个种之间的进化关系，而且将加快芸薹属种间的基因转移，创造芸薹属的新资源。研究表明，A，C基因组来源于相同或相似的基因型，B基因组可能来自另一个地理生境，因此，A，C基因组间的亲缘关系要比它们与B基因组的关系密切[2～5]。Attia等[2]研究不同双单倍体杂种中染色体配对和交叉频率，发现A和C基因组染色体之间的配对情况远好于A，B和B，C，这说明A和C基因组之间可能具有较近的亲缘关系。但是，白菜与甘蓝无法通过常规育种手段直接杂交获得杂交后代，通常采用体细胞杂交或原生质体融合和胚拯救等技术获得二者种间杂种，而白菜（Brassica campestrisL.ssp.pekinensis，2n=20，AA）与甘蓝型油菜（Brassica napus，2n=38，AACC）极易杂交，这些都表明A，B，C染色体组间既存在相似性，又存在复杂性。

北京蔬菜研究中心引进了一份芸薹属异源六倍体复合种CGMCC No.2553材料，该材料兼具有A，B和C染色体基因组。研究表明，应用常规的方法，芸薹属异源六倍体复合种CGMCC No.2553可以与大白菜杂交，但结实率极低。由于芸薹属异源六倍体基因组组成较为复杂，所以先采用游离小孢子培养技术快速纯合重要性状，创造更多能与大白菜杂交的芸薹属新种质，将获得的多类型DH单株与大白菜品种杂交，获得二者的杂交后代。

游离小孢子培养技术已广泛应用于芸薹属作物中，国内已成功将甘蓝型油菜、大白菜等作物的小孢子培养技术应用于育种实践中，并选育出品种。利用小孢子培养获得的DH再生植株不仅可以缩短常规育种周期，而且应用DH永久群体构建的遗传图谱可以用来标记重要性状，定位、克隆重要基因等。

1 材料与方法

1.1 试验材料

芸薹属异源六倍体CGMCC No.2553（AABBCC，n=27）兼具有A，B和C染色体基因组，虽为同一株采收的种子，但芸薹属异源六倍体CGMCCNo.2553个体间差异较大。表现为：有的植株叶片有缺刻，有的植株叶片为板叶；花色有黄花和白花等；茎部有紫色，浅紫色，浅绿色带蜡粉等。芸薹属异源六倍体苗期照片如图1，抽薹、现蕾期照片如图2。

1.2 试验方法

①游离小孢子培养 10月中旬，将芸薹属异源六倍体CGMCC No.2553萌动种子放于4℃冰箱中人工春化15～20 d，11月初播种于日光温室，待长到一定苗龄后定植到日光温室。在第2年盛花期取材，参考已发表的绿菜花游离小孢子培养方法[6]，对供试材料进行游离小孢子培养。

②DH再生植株的获得、留种暗培养20 d后，小孢子胚发育到子叶期，将子叶胚转接到装有B5固体培养基的培养皿中，然后再转移根、茎、叶分化良好的幼苗到三角瓶中，多次继代后获得发育健壮的再生苗，驯化后，定植于日光温室中，人工蕾期自交留种。

③DH再生植株与大白菜杂交种的获得、鉴定 在DH再生植株自交留种的同时，取DH再生植株的花粉分别涂抹到3份大白菜品种柱头上或取大白菜的花粉涂抹到DH再生植株上，获得二者间的杂交种子。播种收获的种子，通过田间性状观察的方法，鉴定杂种的真实性。

2 结果与分析

2.1 DH再生植株的获得

图1 芸薹属异源六倍体的苗期

图2 芸薹属异源六倍体抽薹、现蕾期

图3 芸薹属异源六倍体的子叶胚和胚诱导成苗

图4 芸薹属异源六倍体的再生苗

图5 芸薹属异源六倍体再生植株的不同类型

图6 芸薹属异源六倍体的再生植株群体（抽薹、开花）

芸薹属异源六倍体CGMCC No.2553材料具有胚胎发生能力，可以获得胚状体和再生植株。图3为获得的子叶胚、子叶胚转移到培养皿中诱导成苗。由图3可见，一次培养获得的胚状体数量不多，说明基因型明显影响胚胎发生能力。转移健壮的幼苗到三角瓶中继续生长、分化，形成再生苗（图4）。图4为定植前的再生植株。试验中发现一个有趣的现象，供试材料的子叶胚极易分化出多个再生苗或再生植株，表现为“一胚多苗”的现象，这不仅有利于获得同一基因型的多个再生植株，而且提高了再生株定植成活率。图5为芸薹属异源六倍体再生植株的不同表现。由图5可见，再生植株主要表现为叶片缺刻的深、浅，紫色的有无等区别。图6为芸薹属异源六倍体再生植株群体。由图6可见，DH植株花期长势旺，植株高，分枝多。图7为芸薹属异源六倍体再生植株的花。由图7可见，花瓣颜色有黄色、白色，雄蕊有的可育，有的不育，雄蕊的长短不同等。图8为芸薹属异源六倍体再生植株的花穗、结实。由图8可见，DH再生植株的花较大，结实性好，但每荚中种子数量较少。图9为芸薹属异源六倍体的再生植株的分枝和根部状况。由图9可见，由根部萌发的主枝较多，最多可以达到3～4个。DH再生植株经过一定的低温处理，可以获得一些叶片皱缩突变体（图10）。图11为再生植株与大白菜的杂交种。由图11可见，杂交种表现为中间类型，性状更偏向于大白菜。

图7 芸薹属异源六倍体不同再生植株的花

图8 芸薹属异源六倍体的再生植株花穗、结实

综上所述，获得的DH再生植株性状差异较大，表现为类型多样、性状各异等。性状主要表现为：花色有黄色、白色和浅黄色；花粉有的多，有的少，有的全无；同一朵花的雄蕊有的可育，有的不育，6个雄蕊的长短也不同等。可见，对芸薹属异源六倍体CGMCC No.2553进行游离小孢子培养，可以获得多种类型的中间材料，而且也可以获得与大白菜杂交的中间类型材料。

2.2 DH再生植株的自交结实

2007-2008年，在日光温室中共定植220株DH再生植株。在蕾期，采用人工剥蕾的方法自交留种。目前仅获得12株DH再生植株的自交种子，其余208株再生株因为前期无花粉、花粉少，染色体基因型不配对等内在原因，自交后没有得到种子。但是，在208株DH再生植株中，部分没有套袋的枝条可以获得若干种子，这些种子是自交种子还是杂交种子还有待进一步鉴定。另外，有的DH再生植株初花期花粉量较多，后期逐渐减少，而且多次重复授粉很难得到自交种子，其原因有待于进一步研究。

图9 芸薹属异源六倍体再生植株的分枝和根部状况

图10 再生植株叶片皱缩突变体

更有意义的是，将再生植株置于4～5℃低温条件下处理15～20 d或自然慢慢通过低温处理30～40 d后，定植到日光温室中生长，在生育后期可以获得一些叶片皱缩突变体 （图10）。试验证明，2007-2008年，采用上述方法重复进行试验，每次都能获得一定数量的叶片皱缩突变体。

2.3 大白菜与DH再生株杂交F1代的获得及鉴定

采用3份大白菜 （08-784，08-786和08-916）分别与DH再生株正反交杂交，部分杂交可以正常结实，目前，已经得到4份杂交F1代种子，并获得了幼苗。通过田间植物学性状鉴定，认为是真正杂种。同时，正在采用SSR等分子标记技术鉴定杂交种的真伪性。

3 小结与讨论

3.1 游离小孢子培养

芸薹属异源六倍体CGMCC No.2553的游离小孢子培养技术规程与绿菜花的培养技术相似，热激处理温度为32.5℃1 d，蔗糖浓度以10%为宜。因芸薹属异源六倍体CGMCC No.2553花蕾较大，取材时健康花蕾长度在2.0～3.5 mm为宜。芸薹属异源六倍体的胚胎发生率较低，因为没有详细地研究影响供试材料胚胎发生的各种因素，从而优化培养条件，因此，没有获得较高的胚胎发生率。供试材料单个胚的成苗率较高，一般一个胚可以分化成3株或更多的再生苗，这种现象在大白菜品种的游离小孢子培养中很少发现。“一胚多苗”的优点首先是能够提高DH再生株的成活率，其次有利于获得基因型相同而某些性状不同的突变型和野生型材料，如本研究中获得的叶片皱缩突变体。由于它们只在叶片皱缩单一性状上表现差异，而其他的遗传性状完全一致，因此它们是很好的野生型和突变型材料，为研究叶片皱缩的遗传规律，定位、克隆和分离叶片皱缩基因，并探讨叶片皱缩性状在育种中作为标记性状的应用等提供了可能。

3.2 再生株自交结实

在游离小孢子培养过程中，芸薹属异源六倍体CGMCC No.2553的染色体会发生随机重组、交换等，出现A，B，C染色体间的多种组合，随后有的自然加倍，成为二倍体、异源四倍体或其他多种倍性，因此，DH再生株会出现许多类型，表现在叶片缺刻、茎部颜色、花瓣颜色、花药多少、育性、倍性等性状的不同。在盛花期，有的DH植株由于无花粉、花粉干或花粉不稳定、染色体不配对等，导致自交不结实，在本研究中，220株再生植株仅获得12株再生株的自交种子。

3.3 大白菜与DH再生植株杂交种的获得

所获得的DH单株可以与3份大白菜正反交杂交的F1部分杂交结实正常。目前，已经验证了获得的F1代为真正的杂交种。可见，以芸薹属异源六倍体CGMCC No.2553为材料进行游离小孢子培养，不仅拓宽了芸薹属的种质资源，而且获得的部分DH再生株可以与大白菜品种杂交，为今后获得大白菜DH永久作图群体，构建遗传图谱，开展相关基因的研究奠定了基础，也为研究芸薹属A，B和C染色体的共线性提供了依据。

[1]U N.Genome analysis inBrassicawith special reference to the experimental formation ofB.napusand its peculiar mode of fertilization[J].Jap J Bot,1935,7:389-452.

[2]Attia T,Röbbelen G.Cytogenetic relationship within cultivatedBrassicaanalyzed in amphidiploid from the three diploid ancestors[J].Can J Genet Cytol,1986，28:323-329.

[3]栗茂腾，张椿雨，刘列钊，等.芸薹属A，B和C基因组之间关系研究进展[J].遗传，2005，24（7）：671-676.

[4]孟金陵.芸薹属植物远缘杂交不亲和性的研究进展[J].中国油料，1987（4）：71-77.

[5]冯午，陈耀华.甘蓝与白菜种间杂交的双二倍体后代[J].园艺学报，1981，8（2）：37-40.

[6]张德双，曹鸣庆，秦智伟.绿菜花游离小孢子培养、胚胎发生和植株再生[J].华北农学报，1998，13（3）：102-106.

Regeneration of Plant with Multiple Types from Allohexaploid CGMCC No.2553 in Brassica

ZHANG Deshuang,ZHANG Fenglan,XU Jiabing
(Beijing Vegetable Research Center,Beijing 100097)

Crossing with Chinese cabbage (Brassica campestrisL.ssp.Pekinensis),Brassicaallohexaploid CGMCC No. 2553 (AABBCC,n=27),which owns A,B and C chromosomes simultaneously,was used for isolated microspore culture. The results showed that it could form embryoid and could get regenerated plants.220 regenerated plants were grown at the greenhouse without heating apparatus.12 DH plants got seeds by self-pollination.Through crossing DH lines with 3 Chinese cabbage pure lines,4 F1hybrids were obtained.These hybrids were genuine hybrids by field checkup.They will be used for linkage map construction,locating and cloning the important genes in the future.

Brassicaallohexaploid CGMCC No.2553;Isolated microspore culture;Regeneration of plants;Chinese cabbage;Hybrid F1

10.3865/j.issn.1001-3547(x).2009.06.005

北京市农林科学院青年基金资助

张德双（1969－），男，博士，副研究员，主要从事大白菜育种等研究工作，电话:010-51503038

2008-12-15