大白菜杂交种中熟5号纯度的RAPD鉴定

方淑桂 曾小玲 陈文辉 陈铣

（福州市蔬菜科学研究所，福建福州350012）

大白菜杂交种中熟5号纯度的RAPD鉴定

方淑桂 曾小玲 陈文辉 陈铣

（福州市蔬菜科学研究所，福建福州350012）

利用RAPD-PCR分子标记技术，对大白菜品种中熟5号及其亲本的DNA指纹进行了分析研究，从200个随机引物中筛选出互补带明显的引物S33，构建了相应的DNA指纹图谱。通过对100株中熟5号进行纯度鉴定，结果只有2个有母本特异带，与大田检测的结果完全一致，杂交率达98%。

大白菜 中熟5号 RAPD-PCR 种子纯度

种质和新品种鉴定是农作物新品种开发利用及知识产权保护的依据，目前国内外对农作物品种仍以形态指标鉴定为主，其特点是准确可靠，但检测周期长，不能满足当年用种需要。为缩短鉴定周期，同工酶技术已应用于十字花科蔬菜杂种纯度鉴定，但同工酶多态性不够丰富，同时有组织和器官特异性，大大降低了鉴定的稳定性和准确性。随着分子生物学的快速发展，DNA分子标记技术得到全面发展，以PCR为基础的DNA分子标记技术，如RAPD，SCAR，SSR，ISSR等得以发展与应用。而RAPD分子标记技术具有简单易行、DNA需要量少、检测效率高、试验周期短、随机引物选择不受种属的限制等优点，已被广泛应用于多种作物的种子鉴定[1～5]。

本研究以中熟5号[6]及其亲本为材料，采用RAPD分子标记技术，建立中熟5号品种及其亲本的DNA指纹图谱，为其纯度鉴定和知识产权保护提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

大白菜品种中熟5号及其亲本均由福州市蔬菜科学研究所大白菜课题组提供，采用穴盘育苗，待幼苗长至2片真叶时取嫩叶供试验用。RAPD引物购自上海生工生物工程技术有限公司。

表1 不同引物扩增多态性情况

1.2 试验方法

①DNA提取 随机抽取大白菜品种中熟5号及其父母本各15株，剪取刚展开的健康嫩叶，液氮研磨，采用改良的CTAB法[7]提取总DNA，用紫外分光光度计在260 nm和280 nm下测定OD值，检测DNA的质量和浓度，并稀释到30 ng/μL作为PCR扩增的模板。

②RAPD分析 大白菜RAPD-PCR反应体系优化为25 μL，其中含2.5 μL 10×PCR buffer，250 μmol/L dNTP，0.5 μmol/L引物，2.5 mmol/μL MgCl2，30 ng模板DNA，1 U的Taq酶。

PCR扩增反应在PCR仪上进行，PCR扩增程序为：94℃预变性 4 min；92℃ 60 s，37℃ 90 s，72℃120 s，40个循环；72℃7 min；4℃保存。反应结束后，PCR产物在含有0.5 μg/mL EB的1.4%琼脂糖凝胶中电泳2 h，用捷达凝胶成像系统进行拍照分析。

图1 混合中熟5号品种和父母本基因组DNA的RAPD-PCR扩增

图2 S33扩增F1及其亲本的DNA图谱

2 结果与分析

2.1 特征引物的筛选

用生工S1～S200共200个随机引物，随机提取父本、母本及杂交种15株，建立混合池，进行RAPDPCR引物筛选。结果有40个引物扩增出1～4条带，121个引物扩增出5～10条带，18个引物扩增出10条以上条带（图1）。

选取扩增带谱清晰，模糊带和杂带少，主带突出的70个引物分别扩增大白菜早熟5号杂交种和父母本的基因组DNA。结果显示，有10个引物扩增出多态性带（表1）。其中有4条引物扩增的杂种谱带与父本有差异；有2条引物扩增的杂种谱带与母本有差异；有4条引物扩增的杂种谱带与父母本有差异，分别是引物S4，S33，S155和S170。其中引物S155扩增的与父本的特异带谱比较模糊；引物S170扩增的与其父母本相比，缺失1条父本特异带和2条母本特异带；引物S4扩增的与其父母本相比，缺失1条母本特异带。经多次反复试验，筛选出1个特征引物S33，能同时扩增出早熟5号的杂种及其父母本的多态性条带，其扩增产物具有高度的稳定性和重复性。

2.2 指纹图谱的建立

从图2可以看出，用引物S33扩增中熟5号杂交种及其亲本基因组DNA，母本有一条明显特异带S33-1500，父本有一条明显的特异带S33-550，杂交种同时有这两条明显的特异带。

2.3 杂种纯度的鉴定

将中熟5号杂交种种植于大田中，待幼苗长至2片真叶时，随机抽取100个单株编号，按上述方法提取DNA，选用引物S33进行RAPD的分子鉴定。检出2个单株无父本特异带，说明2株是母本苗，杂交种的纯度为98%。成株期鉴定生物学性状，结果发现2株与母本性状一样，植株矮小、结球松，其余的均结球大而紧实，杂交率为98%。

3 小结

本试验通过优化DNA提取程序，严格控制DNA模板质量，优化反应体系，多次重复筛选，获得多态性稳定且互补带明显的特征引物S33，建立了中熟5号大白菜DNA指纹图谱。在生产田中随机抽取单株并编号，苗期提取DNA进行RAPD分子鉴定，与成株期形态鉴定结果相对应，植株矮小结球松散的与分子标记缺失父本带的一致，这样更准确地鉴定中熟5号杂交种纯度，说明利用DNA指纹图谱进行大白菜品种鉴定是可行的。

[1]贾继增.分子标记种质资源鉴定和分子标记育种[J].中国农业科学，1999，29（4）：1-10.

[2]李莉，邵登魁，钟启文.RAPD技术在蔬菜种质资源研究中的应用[J].青海大学学报：自然科学版，2007，25（5）：58-61.

[3]郝风，李成琼，宋明，等.西园四号甘蓝纯度的RAPD鉴定及其在杂交制种中的应用[J].中国农学通报，2006，22（5）：43-45.

[4]戴修纯，王佛娇，谢伟平，等.利用RAPD技术快速鉴定番茄种子纯度[J].中国蔬菜，2006（8）：23-24.

[5]Ballester J G.Determination of hybrid seed purity inpepper using PCR-based markers[J].Euphytica，1998（3）：212-219.

[6]方淑桂，陈文辉，曾小玲.大白菜新品种中熟5号的选育[J].中国蔬菜，2001（6）：32-33.

[7]王关林，方宏筠.植物基因工程[M].北京：科学出版社，2002：742-744.

Identification of Seed Purity of Hybrid Chinese Cabbage Zhongshu No.5 by RAPD Markers

FANG Shugui,ZENG Xiaoling,CHEN Wenhui,CHEN Xian
(Fuzhou Institute of Vegetable Science,Fuzhou 350012)

Using the RAPD-PCR molecular marker technology,the DNA fingerprints of Chinese cabbage Zhongshu No.5 and their parents were analyzed.A characteristic primer S33 showed complementary type bands of their parents was screened from 200 random primers.The DNA fingerprinting of Chinese cabbage Zhongshu No.5 was constructed,which adopted to identify the seed purity of Chinese cabbage Zhongshu No.5.Using the purity identification method,two plants showed female parent bands in 100 Zhongshu No.5 plants,which was exactly the same with the field testing.The hybrid rate was 98%.

Chinese cabbage;Zhongshu No.5;RAPD-PCR;Seed purity

10.3865/j.issn.1001-3547(x).2009.06.006

科技部成果转化资金项目（02EFN213500309）；福建省科技成果转化重点项目（2006T0030）

方淑桂（1956-），女，大专，研究员，研究方向为蔬菜遗传育种和生物技术，电话：13720836739。E-mail：fangshugui@126.com

2008-10-17