罗格列酮对体外高糖培养乳鼠心肌细胞凋亡的影响

于洪宇　马春宇

[摘要] 目的 探讨罗格列酮对体外高糖培养乳鼠心肌细胞凋亡的影响。方法 SD乳鼠进行原代心肌细胞培养48h后,换无血清的DMEM培养基并转移到24孔板上,随机分为3组,分为培养心肌细胞不加入葡萄糖组,加入25mmol/L葡萄糖组,加入25mmol/L葡萄糖以及10μmol/L罗格列酮组。48h后,分别测定各组心肌细胞乳酸脱氢酶含量;四唑盐比色法测定各组心肌细胞的生长情况及增殖活性;流式细胞仪检测各组心肌细胞的凋亡情况。结果 与正常对照组相比较,经过罗格列酮干预后,乳酸脱氢酶含量显著下降;四唑盐比色结果显示心肌细胞存活率增高;流式细胞仪检测发现坏死细胞和凋亡细胞明显减少。结论 罗格列酮能够抑制体外高糖培养的乳鼠心肌的细胞凋亡。

[关键词] 心肌细胞; 细胞凋亡; 损伤; 糖尿病

[中图分类号] R587.2;R542.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2009)23-19-03

The Effect of Rosiglitazone on High Glucose on the Cardiomyocytes Apopotosis in Cultured Neonate Rat

YU Hongyu MA Chunyu

The Graduate College of Liaoning Medical University,Liaoning 121001,China

[Abstract] ObjectiveTo investigate the effect of rosiglitazone on high glucose on the cardiomyocytesapopotosis in cultured neonate rat. MethodsAfter 48 hours cultured the primitive cardiomyocytes of Sprague-Dawley neonate rats,continuing to culture them in the DMEM medium without serum,changing culture fluid,tranfering them to the 24-holl-medium,were randomLy divided into 3 equal groups:the normal control group,the 25mmol/L glucose group,the 25mmol/L glucose and the 10μmol/L rosiglitazone group. The lactate dehydrogenase of the neonate rat cardiomyocytes were determined. At the same time,we determine the living rate of cardiomyocytes by MMT and we observe the cardiomyocytes apopotosis with the Flow Cytometer. ResultsCompared to the normal control group,in the rosiglitazone group,the lactate dehydrogenase of the neonate rat cardiomyocytes remarkablly decreased;the cell living rate obviously increased by MMT;the necrosis and apopotosis cells obviously reduced with the Flow Cytometer. ConclusionThe rosiglitazone could inhibit the apopotosis of the cultured cells of neonate rats remarkably.

[Key Words]Cardiomyocytes; Apopotosis; Injury; Diabetes

糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病患者的一个严重并发症。心肌细胞有不可再生的特点,且心肌细胞凋亡可能是导致糖尿病心肌细胞丢失及心力衰竭的重要原因之一[1]。研究糖尿病时如何对抗心肌细胞凋亡具有重要意义,因此找到抑制心肌细胞凋亡发生的途径是防止DCM发生的重要手段。

国内外临床研究显示,罗格列酮(rosiglitazone,RSG)可使空腹血糖(FPG)和糖化血红蛋白(HbA1c)显著下降,可改善血糖控制情况;同时伴有血胰岛素和C肽水平降低,也可使餐后血糖和胰岛素水平下降;其对血糖控制的改善作用较持久。唐晓红[2]等研究发现RSG能够使高糖刺激下的肾小管上皮细胞凋亡减少,并且有明显的时效关系。但RSG对体外高糖培养的心肌细胞是否具有抑制凋亡的作用报道较少。本实验拟在体外模拟糖尿病时体内高血糖环境,并研究RSG对高糖环境的心肌细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 Sprague-Dawley乳鼠,出生1～3d,雌雄不拘,由辽宁医学院实验动物中心提供。

1.1.2 主要实验试剂及仪器 DMEM培养基(Sigma公司),Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒(北京宝赛生物技术有限公司),XD-101型倒置显微镜(Olympus Tokyo JAPAN),流式细胞仪(BD Facscalibur USA),二氧化碳孵箱(Sheldon Manufacturing Inc USA),罗格列酮原粉剂(史克必成天津制药有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 乳鼠心肌细胞的培养 在无菌的条件下,取出生2～3d的SD乳鼠,开胸取出心脏。用D-Hanks液冲洗三次后剪成约1mm³大小的碎片,加入0.08g/L胰蛋白酶消化细胞。取消化完毕后的细胞,加入体积分数为15%的小牛血清,84%的DMEM培养基,接种并于CO₂孵箱常规培养48h。

1.2.2 实验分组及给药方法 将上述细胞转移到两个24孔板上,随机分为3组,每组16孔,换培养基的同时给药,每组给药如下,正常对照组:正常培养心肌细胞,不加入葡萄糖;葡萄糖浓度为25mmol/L组;葡萄糖浓度为25mmol/L组+RSG10μmol/L组。给药48h后,分别测定以下指标。

1.2.3 乳酸脱氢酶含量的测定 取培养后心肌细胞的上清液,经全自动生化分析仪测定乳酸脱氢酶活力,作为判断心肌细胞损伤程度的指标。

1.2.4 四唑盐比色法测定心肌细胞生长及增殖活性 各组细胞于测试前4h,每孔加入2mg/mL的MTT液(50μl/孔);于CO₂孵育箱中继续培养4h后弃去培养液,每孔加入DMSO 0.15mL,充分振荡10min后使结晶充分溶解,上酶标仪检测570nm波长处各孔的吸光度值(OD值)。

1.2.5 流式细胞仪检测培养心肌细胞的凋亡率 流式细胞仪采用FITC- Annexin- V/PI双染法进行细胞凋亡检测分析,流式细胞仪激发光波长用488nm,用一波长为515nm的通带滤器检测FITC(异硫氰酸荧光素)荧光,另一波长大于560nm的滤器检测PI(碘化丙啶)荧光。

将心肌细胞培养48h后用0.25%胰蛋白酶消化,PBS洗涤2次,并调整细胞密度为1×106g/L,制成单细胞悬液,直接收集到10mL的离心管中,每样本细胞数为(1～5)×106/mL,1000r/min离心5min,弃去培养液。用孵育缓冲液洗涤1次,1000r/min离心5min。用100μl的标记溶液重悬细胞,室温下避光孵育15min。1000r/min离心5min沉淀细胞孵育缓冲液洗1次。加入荧光(SA-FLOUS)溶液4℃下孵育20min,避光并不时振动。在双变量流式细胞仪的散点图上,可同时描述三群不同状态细胞:左下象限FITC-/PI-细胞,即正常活力细胞;右下象限FITC+/PI-细胞,即凋亡细胞;右上象限FITC+/PI+细胞,即已死亡细胞。

1.3 统计学分析

实验数据计量资料用均数±标准差(χ±s)表示,采用SPSS12.0统计软件进行多组间单因素方差分析,P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 各组乳酸脱氢酶含量及四唑盐比色法结果

高糖刺激下,乳酸脱氢酶含量明显增高,心肌细胞存活率明显下降,而经过罗格列酮干预后,乳酸脱氢酶含量下降,心肌细胞存活率明显增高,各组之间比较具有显著性差异(P<0.01)。见表1。

2.2 流式细胞仪检测结果

从流式细胞仪的双变量散点图上可以看出,正常对照组仅有少量的坏死细胞和凋亡细胞;葡萄糖25mmol/L组可见较多的凋亡细胞和坏死细胞;而经过罗格列酮干预后,坏死细胞和凋亡细胞明显减少,但与正常对照组相比较,仍有一定的差异。见图1、2、3。

3 讨论

心肌细胞凋亡是产生糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)的基础。而判断心肌细胞凋亡一般采用测定心肌细胞内含量较多的酶类、四唑盐比色法测定心肌细胞生长及增殖活性、流式细胞仪检测等方法。本研究显示,体外培养的高糖干预下的心肌细胞内乳酸脱氢酶含量增高,四唑盐比色法结果显示心肌细胞存活率降低,流式细胞仪检测显示高糖培养下,坏死和凋亡的心肌细胞明显增多。这些均说明高糖环境对体外培养的乳鼠心肌细胞具有促进凋亡的作用,同时也为后续进行药物干预的研究打下了前期基础。

而罗格列酮(rosiglitazone,RSG)对体外高糖环境下心肌细胞培养的干预后,LDH含量显著下降;四唑盐比色法结果显示心肌细胞存活率显著升高;流式细胞仪检测的心肌坏死细胞和凋亡细胞明显减少。说明RSG在体外高糖环境下对心肌细胞的培养具有抑制乳鼠心肌细胞凋亡的作用。进而可以提示RSG对体外高糖培养的乳鼠心肌细胞具有保护作用。

噻唑烷二酮类药物有抑制细胞凋亡、增殖的作用[3]。RSG是其代表性药物,它是一种新型的胰岛素增效剂,通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(Peroxisome proliferators activated receptor-γ,PPAR-γ)而显著改善2型糖尿病患者的胰岛素抵抗,高胰岛素、高脂血症、高血糖症而广泛应用于临床。但其保护心肌细胞的作用可能存在其他机制:在体外实验中已证明RSG可以通过降低内皮素-1(endothelin-1,ET-1)的浓度而抑制心肌肥大[4]。大鼠心肌细胞有内皮素特异性受体,在培养新生大鼠心肌细胞中,ET-1可诱导心肌肥大、增加蛋白质的合成,是引起心肌肥大的因子[5]。而RSG可能减少了随后Na+/H+交换和Na+/Ca2+交换的激活,抑制钙的内流,减轻细胞的钙超载,进而抑制了ET-1引起的心肌肥大[6]。RSG还可以降低心肌细胞丙二醛含量,说明RSG可以抑制脂质过氧化的作用,即RSG在高胆固醇血症中保护心肌细胞的损伤可能与抗氧化作用有关[7]。此外RSG是胰岛素的增敏剂,胰岛素对心肌细胞的损伤有保护作用[8],因此RSG如果在体内抑制心肌细胞凋亡的作用将会进一步加强。以上机制只是对RSG抑制心肌细胞凋亡的探讨,其确切机制尚需以后的实验进一步证实。

[参考文献]

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(收稿日期:2009-03-25)