吉西他滨联合维生素C、维生素K3应用于人膀胱癌T24系的实验研究

许海龙 刘俊生

膀胱肿瘤是泌尿系统最常见的恶性肿瘤,近年来发病率及病死率在我国呈上升趋势。吉西他滨对膀胱肿瘤具有不错的疗效，常见的是吉西他滨联合顺铂方案，但该方案对肾脏的损害作用限制了其在高龄及有肾功能和潜在肾功能损伤患者中的应用。国内外不少学者报道，维生素C、维生素K3对某些肿瘤细胞系的增殖具有抑制作用，并能诱导肿瘤细胞发生凋亡。本实验旨在观察吉西他滨联合维生素C和维生素K3对体外培养的膀胱肿瘤细胞抑制增殖和促进凋亡的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 吉西他滨（LILLY FRANCE S.A公司，注册证号H 20050171），维生素C、维生素K3（Sigma公司，USA），RPM 1640培养基，小牛血清（四季青公司）。四氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO），胰蛋白酶，碘化丙啶（PI），均为Sigma公司产品。流式细胞仪（B-D公司，USA，FACScalibur型）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人膀胱癌T24细胞株（山西医科大学中心实验室提供）。培养液为含10％小牛血清和100U/m l青霉素、100U/m l链霉素的RPM I1640，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。细胞呈贴壁生长，0.25％的胰酶和0.02％EDTA（1：1）消化传代，每隔2～3天传代一次，处于指数生长期的细胞用于实验研究。

1.2.2 药物处理及分组 分4组：吉西他滨组；VC＋K3组；吉西他滨＋VC＋VK3组；空白对照组。MTT法筛选出前两组药物作用的最佳浓度。空白对照组加入等体积培养液。

1.2.3 MTT检测

（1）吉西他滨浓度的筛选 取指数生长期细胞，0.25％胰酶消化，细胞密度为5×104/孔接种于96孔板，贴壁24h后，分别加入不同浓度的吉西他滨（0.01、0.1、1、10ug/m l）,每浓度设5个复孔，空白对照组加入等体积培养液。药物作用时间为72h。在试验结束前4h,取出培养板，加入MTT（5g/L）20UL，继续培养4h后，吸弃上清，加入100u lDMSO,于微量板式振荡器振荡10m in,用酶标仪在590nm波长处读取吸光度（A）值。

细胞生长抑制率=（对照组A 490值-实验组A 490值）/对照组A 490值×100％。

（2）吉西他滨联合VC＋VK3浓度的筛选 选用吉西他滨作用72h后的最佳浓度，联合一定比例（VC：VK3＝100：1）[1]不同浓度的VC＋VK3（100：1、250：2.5、500：5、1000：10umol/L），筛选出VC+VK3的最佳浓度。准备方法和药物处理同上。

1.2.4 流式细胞仪检测 收集各组药物作用72h后的T 24细胞（1.0ug/m l吉西他滨；1000：10um ol/LVC+VK3；1.0ug/m l吉西他滨＋1000：10umol/LVC+K3；空白对照组加入等体积培养液），使用磷酸缓冲液（PBS）清洗3次，加入冰预冷的70％乙醇4℃下固定12h以上。上机前离心弃去乙醇固定液，PBS清洗，37℃下与含10g/L RNA酶的Tris-HC l缓冲液（pH 7.4）共同培养30分钟。细胞DNA染色用碘化丙锭（PI），流式细胞仪分析测定细胞凋亡及细胞周期分布，Cellquest软件获取荧光信号，采用Mod fit LT2.0软件分析。

1.2.5 统计学处理 所有数据均用均数±标准差表示，采用析因设计资料方差分析，检验水准取α=0.05，以P＜0.05为有统计学意义。采用spss13.0统计软件进行统计学处理。

2 结果

2.1 MTT筛选结果

（1）不同浓度吉西他滨对T 24细胞均有抑制作用，且呈浓度依赖性，结合临床考虑10ug/m l吉西他滨毒性过大,故采用1.00ug/m l为吉西他滨最佳浓度进行以下实验（见表1）。

（2）同一比例（VC：VK3=100：1）不同浓度的VC＋VK3与1.00ug/m l吉西他滨联用，培养72h后，发现不同浓度的VC+VK3均增强吉西他滨对T24细胞的抑制作用，且呈浓度依赖性，其中1000：10um ol/L组的抑制最为明显，故选用该浓度进行以下实验（见表2）。

2.2 吉西他滨联用VC+VK3对细胞凋亡及细胞周期分布的影响

结果显示，作用72h后，吉西他滨联合VC+K3组为（41.39±1.04）％,吉西他滨组为（9.23±1.08）％，VC+VK3组为（17.42±1.09）％,空白对照组细胞凋亡率为（5.92±0.76）％。各药物组与对照组相比差异均有显著性（P＜0.05），联合用药组与单药组相比差异有显著性（P＜0.05）（见图1）。

表1 不同浓度吉西他滨对T24细胞增殖的抑制作用Tab1 The inhibitory effects of different concentration of gem citabine

表2 吉西他滨联用不同浓度VC+VK3对T24细胞增殖的抑制作用Tab2 The inhibitory effects of the combination of gem citabine and VC+VK 3

表3 各组对细胞周期和凋亡的影响（％）Tab3 The influence on cell cycle and apoptosis of each group（％）

注：与对照组相比，*为P＜0.05；与吉西他滨组相比，△为P＜0.05,差异具有统计学意义。

图1 各药物组的细胞凋亡率Fig1 The cell apoptosis rates of each group

方差分析结果显示，吉西他滨组的主效应有统计学意义，细胞凋亡率高于对照组（P＜0.05）；VC+VK3组的主效应也有统计学意义（P＜0.05）；二者之间的交互效应有统计学意义（P＜0.05）。据专业知识，凋亡率越大示药物凋亡作用越强，由表3知,联合用药组凋亡作用强于吉西他滨、VC+VK3单药组，可认为吉西他滨与VC+VK3有协同作用，VC+VK3增强吉西他滨诱导人膀胱癌T24细胞凋亡的作用。表3示联合用药对S期阻滞作用显著。

3 讨论

膀胱肿瘤的发病率国内居泌尿系肿瘤第一位。化疗是唯一能延长晚期膀胱肿瘤患者生存时间并改善其生活质量的治疗方法,可使多数患者的预计生存时间由3～6个月延长至1年左右,少数病人可获得长期生存[2]。吉西他滨是一种新型脱氧胞苷类似物,具有抗瘤谱广、作用机制独特、毒性反应低、与其他化疗药物无交叉耐药且毒性反应无叠加等特点。姚旭东等研究了吉西他滨对膀胱癌细胞系增殖、细胞周期及凋亡的作用，证实吉西他滨对膀胱移行细胞癌的抑制作用，发现细胞分化低、倍增时间短的癌细胞系对吉西他滨更敏感[3]。目前在晚期膀胱癌治疗中，吉西他滨已成为化疗的一线药物,较常见的是吉西他滨联合顺铂方案，但因为该方案的肾毒性限制了其在高龄及有肾功能和潜在肾功能损伤患者中的应用。

近年来的研究显示,维生素C和维生素K3在治疗或作为辅助药联合其他抗癌药物治疗恶性肿瘤方面具有潜在价值。本实验证实了吉西他滨与VC+VK3的协同作用。维生素C作为一种抗氧化剂，在体内可以和氧自由基结合发生还原反应,清除有害的氧自由基,保护细胞的DNA免受氧化损伤；大剂量的VC还对肿瘤细胞具有抑制及杀伤作用。Mu ralik rishnan等在实验中观察到维生素C可抑制环磷酰胺、甲氨蝶呤及5-氟尿嘧啶引起的血浆脂质代谢异常,起到保护化疗个体的作用[4]。Blasiak等的研究中检测顺铂及三氧化硒造成的细胞及基因毒性,结果发现维生素C的保护作用,而对DNA修复的细胞动力学无明显影响,故认为维生素C有助于减轻抗癌药物的副作用[5]。有细胞培养试验表明,低浓度的维生素C对纤维细胞瘤细胞SW 620有一定保护作用,而高剂量则对瘤细胞有杀伤作用,因维生素C对肿瘤细胞的杀伤作用和能降低抗肿瘤药对机体的损伤而被建议作为肿瘤辅助治疗药物。维生素K3为人造的维生素K1衍生物，通过醌的氧化还原反应使体内活性氧簇（ROS）生成增多，超过细胞氧化承受能力，引起细胞死亡。维生素K3与其他维生素联合应用引起的细胞毒作用可能与上述的氧化还原反应有关[6]。在体外实验中，加入维生素C可以增强维生素K3的毒性，导致氧化应激的发生[7]。Noto等证实维生素C和维生素K3以100：1的比例下联合应用时，对人类乳腺癌的抑制作用显著增强[1]。联用时，二者可以在低于常规10到50倍的剂量下协同作用抑制细胞生长，同时药物毒性也相应减少了[1]。

本实验结果显示：联合用药组为（41.39±1.04）％，吉西他滨组培养72h后，其凋亡率为（9.23±1.08）％，与吉西他滨组相比差异有显著性（P＜0.05）。联合用药组诱导凋亡作用明显高于吉西他滨组，证实维生素C和维生素K3增强了吉西他滨诱导细胞凋亡的作用。这与Kassou f等在UMUC-14等细胞中的发现相符[8]。

目前对维生素C和维生素K3诱导细胞死亡的明确机制仍不清楚，有待深入研究。为了探讨联合用药诱导凋亡可能的机制，本实验同时测得了药物处理后的细胞周期分布，发现吉西他滨如其药理学特性，主要作用于S期（46.78±3.6）％，吉西他滨联用VC+VK3后，S期阻滞明显增高（57.50±2.5）％，可见VC＋K3增强吉西他滨诱导T 24细胞凋亡可能与细胞周期阻滞于S期有关，其进一步机制有待深入研究。本实验证实，VC+VK3增强吉西他滨对膀胱肿瘤T24细胞增殖抑制和凋亡诱导作用。其机制可能包括维生素的氧化还原作用形成H2O2、氧化应激、DNA损伤和细胞膜损伤,在其过程中一些关键性蛋白的磷酸化水平改变导致的细胞核因子κB（NF-κB）的活化抑制是细胞内主要信号转导路径。在Bach leitner-Hofmann等用维生素C和三氧化二砷（As2O3）共培养急性前髓细胞性白血病（APL）细胞的实验中,发现维生素C并不是抗肿瘤细胞凋亡,而是协同A s2O3诱导APL细胞凋亡[9]。Verrax等研究也表明维生素C能协同维生素K3杀伤肿瘤细胞,并指出主要是因为能激活肿瘤细胞死亡所需的酸性或碱性DNase,从而促进肿瘤细胞凋亡或死亡[7]。同时该研究中还观察到一种新型的细胞死亡类型，自凋亡（auto sch izis）[7,10]。Gilloteaux等将维生素C与维生素K3同加入培养的膀胱癌细胞系T24中,也观察到这种不同于凋亡的死亡类型[11]。

综上所述，本实验表明吉西他滨联合维生素C和维生素K3协同作用于人膀胱癌T 24系细胞增殖，VC+VK3增强吉西他滨诱导肿瘤细胞凋亡的作用，为临床联合用药提供了依据和指导。

[1]Noto,V.,Taper,H.S.,Jiang,Y.H.,et al.Effects of sodium ascorbate（vitamin C）and 2-methyl-1,4-naphthoquinone（vitamin K3）treatment on human tumor cell growth in vitro.I.Synergism of combined vitaminC and K3action[J].Cancer,1989,63：901.

[2]HussainSA,JamesND.The systemictreatment of advanced and metastatic bladder cancer[J].LancetOncol,2003,4：489-497.

[3]姚旭东,叶定伟,朱江,等.吉西他滨对膀胱癌细胞系增殖、细胞周期、凋亡的影响[J].中国癌症杂志,16（12）：1019-1022.

[4]Muralikrishnan G,Amalan S V,Sadasivan P K.Dual role of vitamin C on lipid profile and combined application of cyclophos-phamide,methotrexate and 5-fluorouracil treatment in fibrosarcoma bearing rats[J].Cancer Lett,2001,169（2）：115-120.

[5]Blasiak J,Kowalik J.Protective action of vitamin C against DNA damage induced by selenium cisplatin conjugate[J].Acta Biochim Pol,2001,48（1）：233-240.

[6]Taper H.S.,Roberfroid M.Non-toxic sensitization of cancer chemotherapy by combined vitamin C and K3pretreatment in a mouse tumor resistant to oncovin[J].Anticancer Res,1992,12：1651-1654.

[7]Verrax,J.,Cadrobbi,J.,Delvaux,M.,et al.The association of vitamins C and K3kills cancer cells mainly by autoschizis,a novel form of cell death.Basis for their potential use as coadjuvants in anticancer therapy[J].Eur J Med Chem,2003,38：451.

[8]Kassouf,Wassim.Vitamins C and K3Sensitize Human Urothelial Tumors to Gemcitabine[J].Journal of Urology,2006,176（4）：1642-1647.

[9]Bachleiyner-Hofmann T,Gisslinger B,Grumbeck E,et al.Arsenic trioxide and ascorbic acid：energy potential implications for the treatment of acute myeloid leukemia？[J].Br J Haematol,2001,112（3）：783-786.

[10]Jamison,J.M.,Gilloteaux,J.,Taper,H.S.,et al.Autoschizis：a novel cell death[J].Biochem Pharmacol,2002,63（10）：1773.

[11]Gilloteaux J,Jamison JM,Arnold D,et al.Ultrastructural aspects of autoschizis：a new cancer celldeath induced by the synergistic action of ascorbate/menadione on human bladder carcinoma cells[J].Blood，2001,18（2）：183-192.