生物防腐剂乳酸菌素的研究进展

刘长建,姜 波,崔玉波,刘 秋,齐小辉

(大连民族学院生命科学学院,辽宁大连 116600)

乳酸菌素是某些乳酸菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有生物活性的蛋白质、多肽或前体多肽,可以抑制食品中的致病菌和腐败菌,包括蜡状芽胞杆菌、肉毒梭状芽胞杆菌、产气荚膜梭菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌等,从而减少或避免食品化学防腐剂所带来的安全隐患。而且与抗生素相比,乳酸菌素是由安全的食品级微生物产生的,而且作为蛋白或多肽类物质可以被肠道系统的水解蛋白酶分解,对肠道微生物菌群没有不利影响。正是基于这些特性,有关乳酸菌素的基础和应用研究成为目前食品微生物领域的热点问题[1-4]。

1 乳酸菌素定义

1925年,Gratia发现1株大肠埃希菌对其他的大肠埃希菌有抑菌活性,这种活性物质被称为大肠埃希菌素(colicine)。1953年,Jocob等对由细菌产生的对同源细菌具有高度专一的抗菌蛋白物质统称为细菌素(bacteriocin)。1978年,Konisky提出细菌素是某些细菌通过核糖体合成机制产生的分泌释放到环境中的一类具有抑菌活性的蛋白或多肽,其抑菌范围不仅仅局限于亲缘关系较近的种。而由乳酸菌产生的细菌素就叫做乳酸菌素,到目前为止普遍接受的观点是：乳酸菌素是一类由质粒DNA编码形成的,在细胞溶解时释放并通过专一位点结合而对近缘相关种有致死作用的活性蛋白类物质,产生菌对其乳酸菌素具有自身免疫性[1,4-5]。

2 乳酸菌素分类、性质

根据乳酸菌素的分子量、热稳定性和修饰氨基酸的种类,可将其分为4类：①羊毛硫细菌素：它在乳酸菌的核糖体中合成,是一类小分子的修饰肽,分子内通常含有脱氢(不饱和)氨基酸、羊毛硫氨酸或β-甲基羊毛硫氨酸,如Nisin、Lacticin481、LacticinJ49、PlantaricinC等;②热稳定的小分子肽：其结构特征为N末端信号肽序列长度为18～21个氨基酸,前导肽链由一个蛋氨酸开始,并常随一个赖氨酸;有活性的细菌素其N-末端+1的位置上通常是赖氨酸或精氨酸,如Pediocin-PA-1、Sakacins A、SakacinsP、LeucocinA、EnterocinA、Carnobacteriocins、LactococcinsG、LactococcinsF、LactacinF、PlantararicinsEF、PlantararicinsJK等;③热敏感大分子细菌素：分子量一般大于30 ku,如Helveticins J、Enterolysin A等[2,6];④复合型的大分子复合物：除蛋白质外还含有碳水化合物或脂基团,如leuconocin S、lactocin 27[7-8]。目前国际上研究最深、应用最广的乳酸菌素是乳酸乳球菌产生的Nisin(乳链球菌肽),Nisin的抗菌谱包括抑制链球菌、葡萄球菌、芽胞菌属的一些种、梭菌及其他乳杆菌,可抑制芽胞的形成,而对人未发现毒性[9]。

乳酸菌素除种类繁多外,性质也有很大差别。从抑菌谱看,大量的研究表明,部分乳酸菌产生的乳酸菌素不仅对近缘相关的种有抑制作用,而且对革兰阳性和部分革兰阴性菌也有良好的抑制效果,特别是当与各类螯合剂(如EDTA)结合后,其抑菌范围甚至拓宽到革兰阴性菌,抑菌活性也大大提高。从对热、pH值和蛋白酶的敏感性来看,乳酸菌素的敏感性和耐性差异很大。因此,尽管确定了许多乳酸菌素或类细菌素物质,但发现这些乳酸菌素在数量、遗传基因的位置、后翻译修饰和抑菌模式等方面差异很大[10]。

3 乳酸菌素的生物合成

乳酸菌素是通过核糖体蛋白合成机制,包括转录和翻译来合成的。乳酸菌素有的是染色体编码(如Nisin、LactacinB、LactacinF、HelveticinJ等),有的由质粒编码(如Diplococcin、Lacticin481、Lactococcins、Pediocins、SakacinA、Lactocins等),而CarnobacterocinB1则是染色体和rDNA都参与了乳酸菌素活性的编码。大多数革兰阳性菌的乳酸菌素是由质粒基因编码的,与乳酸菌素合成相关的基因组通常还包括乳酸菌素合成基因,以及编码在转录调控、翻译后修饰、加工转运到细胞表面和菌株的自我保护性(免疫性)中发挥作用的蛋白产物的其他基因[8,11-12]。大部分乳酸菌素是由前体肽产生的,这些前体肽有一个短的N-端前导序列(包括18～24个氨基酸),在翻译后的修饰中,这个部分被切除掉产生成熟的乳酸菌素。目前对于这个前导肽的作用仍未可知,它并未表现出信号序列的所有特征。

乳酸菌素不同于青霉素等抗生素,为多肽或蛋白质;此外,传统的多肽抗生素是由细胞多酶复合体催化形成的,不存在结构基因;而乳酸菌素由基因编码,可以通过基因工程加以改造。例如多肽抗生素(如杆菌肽)是由一系列的多酶复合体的酶反应所合成的,而乳酸菌素是由核糖体合成的前体肽经过酶修饰后合成[4,13]。

4 影响乳酸菌素产量的因素

乳酸菌素通常在指数期向平稳期转换时产生,如Nisin就是在指数中期开始产生,在细胞生长进入平稳期时达到最大值[14]。许多研究表明,乳酸菌素的生物合成对pH有很强的依赖性,当pH值小于5.0时才有大量乳酸菌素产生,60%以上的乳酸菌素是在这时产生的,这是由于只有在这一时期和酸性条件下无活性的Pediocin才向有活性的Pediocin转化。相反,Prenisin、Preleuconocin、Presakecin转化为有活性的Nisin、Leuconocin和Sakecin需要较高的pH值,并且是在细胞生长时期大量形成。另外决定乳酸菌素产量的因素还有菌株、培养基组成、培养时间和最适生长温度。乳酸菌素具有作为食品生物防腐剂以控制腐败和病原细菌的潜在用途,为了能在食品中更经济地使用,简单和经济的培养基,如含有食品级肠粉的TGE或TGE缓冲培养液,在合适的pH条件下培养,可以获得较高的产量[15-16]。

5 乳酸菌素活性检测方法

乳酸菌所产生的乳酸菌素各不相同,其抑菌谱也不同,有的乳酸菌素具有较宽的抑菌谱,而有的抑菌谱较窄,甚至没有抑制腐败菌的能力。到目前为止,乳酸菌素活性的检测主要采用固体检测法,也称琼脂扩散法,最常用的有杯碟法、滤纸片法和点种法。具体操作：在无菌平皿中倒入10 mL加热融化的素琼脂(2%),待其充分冷却凝固后,放入数个已灭菌的牛津杯。将固体检测培养基融化后冷却至50℃左右后加入指示菌液至106个/mL,迅速混合均匀,倒平板,冷却后取出牛津杯。分别向孔洞里加入等量的相同稀释倍数的乳酸菌素液,培养后用游标卡尺准确测量抑菌圈直径。抑菌圈大小与乳酸菌素活性强弱呈正相关[17-18]。

也可将待测乳酸菌素溶液进行偶数倍稀释,用移液器取10μL各稀释倍数的稀释液,按顺序分别加到含有指示菌(106个/mL)的平板上,吸收后倒置培养,记录没有活性时的最小稀释倍数为n,设这时稀释液的活性为U/10μL,则乳酸菌素活性值等于最终稀释倍数与稀释液的活性的积[19-21]。

6 乳酸菌素的利用方式

目前,乳酸菌素可直接投放到食品中;也可与各类螯合剂结合,提高抑菌活性谱,扩展应用范围;或者直接在食品中添加产乳酸菌素的菌体细胞,形成的乳酸菌素不仅能够抑制革兰阳性菌,而且能够抑制革兰阴性腐败菌和病原菌,延长食品的保藏期限;有时乳酸菌素产生的乳酸菌也可以作为发酵剂发酵的副产物存在于成熟奶酪、酸奶、腊肠、泡菜等食品中,达到保存食品的目的。目前已有60多个国家在乳制品、肉制品、蔬菜产品、罐头、鱼产品、乙醇类饮料等食品中使用Nisin作为安全、无毒、天然的食品防腐剂[1-2]。

许多研究证明,具有产乳酸菌素能力的发酵剂在发酵过程中可以防止和控制不良菌丛引起的污染。因此在发酵食品和活菌制剂中使用产乳酸菌素的乳酸菌以及在食品中添加产乳酸菌素的乳酸菌比直接添加乳酸菌素更可取。然而并不是所有的乳酸菌都产乳酸菌素,若通过生物工程技术将乳酸菌素的结构基因克隆到生产中应用的菌株中,将具有更广的应用价值,同时为人工合成大量的乳酸菌素提供了可能[22-23]。

7 乳酸菌素的食品安全性

乳酸菌制剂在工业、农业和医药等与人类密切相关的重要领域应用价值很高。与益生作用有关的(如乳杆菌属、乳球菌属、肠球菌属、双球菌属等)狭义的乳酸菌属于益生菌,尤其受到人们的重视,关于其安全性也在评估中。

由于长期以来乳酸菌一直为人们所食用,被普遍认为是安全的微生物有机体。而且奶制品的流行病学数据和益生菌安全性的总回顾,显示乳酸菌没有涉及人类疾病传染的证据。乳酸菌安全性争议最大的是肠球菌。关于粪肠球菌制剂在人体的有效性和安全性曾经有人进行了2个随机的双盲实验。实验表明160例扁桃体病人服用肠球菌菌株是有效和安全的。对106例免疫缺陷所致的各种慢性呼吸道感染患者,试验结果也表明了粪链球菌的有效性和安全性。内源性乳酸菌,尤其是定植于健康人肠道的乳酸菌未发现任何副作用,对人是安全的。1989年美国食品药品管理局(FDA)和美国饲料公共协会(AAFCO)批准可以作为安全的益生菌菌种42株,其中包括屎肠球菌和粪肠球菌[24]。

但是由于乳酸菌在食品中的浓度变化很大,而且目前国际也没有发酵食品中细菌水平的统一标准。所以乳酸菌及乳酸菌素的消费始终保留着可能导致疾病和个体可能对特异菌株有不同反应的可能性。食品生产企业需要在添加新乳酸菌菌株之前仔细评价其安全性[25]。

8 乳酸菌素研究中存在的问题及展望

随着研究的深入,乳酸菌素的应用前景越来越受到人们的广泛关注,然而在乳酸菌素的研究中仍存在许多有待解决的问题,主要体现在：①乳酸菌素的产量普遍较低,目前的研究方向主要集中在筛选高产菌株及构建工程菌株上;②乳酸菌素的抑菌谱普遍较窄,目前报道的乳酸菌素一般只对革兰阳性菌有抑制作用,而对革兰阴性菌、霉菌和酵母菌没有作用,而且不同种属的抑菌机制尚不十分清楚;③乳酸菌素在不同食品介质中的溶解性和稳定性较差,限制了它们的广泛应用;④评价其应用潜力的工作仍然是以一般性报道为主,尚有待更深入的研究[4,20]。

在今后的一段时间中,乳酸菌素的研究重点可能会集中在以下几方面：①根据已知蛋白质结构设计全新的氨基酸序列,人工合成新型乳酸菌素或对现有的乳酸菌素进行改造,提高乳酸菌素的应用潜力;②通过修饰编码蛋白质的DNA序列,利用DNA重组技术产生满足人们要求的活性多肽或蛋白质;③提高乳酸菌素产量水平,拓宽乳酸菌素抑菌谱,提高乳酸菌素的溶解性和稳定性;④对乳酸菌素产生菌株的自身免疫性机制进行深入研究。随着人们对乳酸菌生理功能和保健功能的认识以及分子生物学技术的飞速发展,乳酸菌素在食品领域将获得广泛的应用,集中多种有益基因的食品级乳酸菌菌株和工程菌菌株将不断出现,并给人类带来巨大的经济、社会和生态效益。

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