HuR蛋白在卵巢浆液性肿瘤组织中的表达及其意义

王晓娜 成丽

原发性卵巢恶性肿瘤是病死率最高的妇科恶性肿瘤。因其临床症状隐匿，确诊时多数患者已属晚期，相当一部分患者在手术和化疗后仍会出现疾病的进展或复发。因此，进一步明确卵巢癌发生、发展的分子生物学机制，寻找早期诊断及有效治疗卵巢癌的方法成为广大学者们研究的焦点。人抗原R(human antigen R，HuR)是人胚胎致死异常视觉(embryonic lethal abnormal vision，ELAV)家族中的一员，是一种RNA结合蛋白，能够与许多编码细胞调节蛋白、生长因子及其受体、炎性介质、诱导酶等基因的mRNA 3＇－非翻译区结合，继而增加这些mRNA的稳定性，提高蛋白质的表达水平［1］。近年来，国外对HuR在卵巢癌、乳腺癌、脑肿瘤等中研究较多［2－4］，并提出卵巢癌细胞质中HuR高表达与不良预后及淋巴结转移相关［2］，但国内关于HuR在卵巢浆液性肿瘤中的表达情况研究尚少。本文对HuR蛋白在卵巢浆液性肿瘤组织中的表达及其意义进行探讨。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2007至2009年在我院手术切除并经病理学检查证实的62例新鲜组织标本。其中正常卵巢组织10例(正常组)，卵巢浆液性瘤组织标本20例(良性组)，卵巢浆液性癌组织标本32例(卵巢癌组)。患者术前未经放射、化学及激素治疗，所有组织标本均由两名有经验的病理科医生确诊。

1.2 实验方法

1.2.1 标本制作:组织经4%甲醛固定12 h，不同浓度乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，4μm连续切片，用黏附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上，将载玻片放入60℃温箱中干燥。

1.2.2 免疫组化染色(SP法):切片经二甲苯脱蜡，再逐级经纯乙醇及梯度乙醇直至蒸馏水水化。染色步骤严格按SP试剂盒说明书进行。鼠抗人COX-2单克隆抗体、免疫组化试剂盒及染色试剂盒均购自北京中杉金桥生物有限公司，兔抗人HuR单克隆抗体(美国Santa Cruz产品)用抗原稀释液稀释为1∶160，抗原修复条件为:微波抗原热修复。pH值6.0柠檬酸作为缓冲液。二氨基联合苯胺(DAB)染色后，苏木素复染，中性树胶封固。磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)代替一抗作阴性对照，以已知阳性的人结肠癌组织为阳性对照。

1.3 结果判定 所有切片采用盲法由两位病理科医生独立阅片，HuR阳性染色为棕黄色颗粒，定位于细胞浆及细胞核中。每张切片于400倍光镜下随机选取4个视野，采用Meta Morph/DP10/BX41显微图像分析系统，对其中一个具有代表意义阳性结果的视野的棕黄色颗粒进行标记，以此标准自动检测所有视野的阳性结果应用imagepro－plus(+)计算每张切片中HuR蛋白积分光密度值(IOD)，以参数积分光密度(IOD)代表蛋白颗粒密度。

1.4 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，将灰度值取倒数，计量资料以¯x±s表示，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组HuR瞬间表达细比较 HuR染色出现在细胞核及细胞浆中。其在正常卵巢、卵巢浆液性瘤及卵巢浆液性癌中的表达有胞浆染色逐渐增强、胞核染色逐渐减弱的趋势。卵巢浆液性癌中HuR蛋白的IOD，显著高于卵巢浆液性瘤和正常卵巢，差异有统计学意义(P＜0.05)。两两比较差异均有统计学意义(P ＜0.05)。见表 1。

表1 3组HuR蛋白表达比较

2.2 HuR蛋白与卵巢浆液性癌临床病理特征的关系 HuR蛋白的表达与卵巢浆液性癌的淋巴结转移有关(P＜0.05)。见表2。

表2 HuR蛋白与卵巢癌临床病理特征的关系¯x±s

3 讨论

真核细胞内转录和翻译过程发生于不同的细胞部位，使得遗传信息从DNA流向蛋白质的过程中，可以在多点成功实现调控。mRNA水平的转录后调控是基因表达中的重要调控点，转录后基因的调控可以通过改变翻译效率和mRNA稳定性实现［5］，涉及这种调节的序列大多群集于转录本的非翻译区(untranslated regions，UTR)，包括5'UTR 和3'UTR。3'UTR 可以调节转录本的稳定性、定位和翻译水平。位于许多基因的3'UTR的腺嘌呤和尿嘧啶的序列(AU-rich elements，AREs)，如AUUUA和AUUUUA序列，是调节mRNA更新的最常见的顺式作用元件。研究表明，多种RNA结合蛋白可以与上述顺式作用元件结合，从而调控mRNA的降解速率。HuR蛋白是最具有代表性的RNA结合蛋白之一，HuR基因位于人类第10号染色体短臂1区3带第二亚带，编码的蛋白是胚胎致死异常视觉(ELAV)家族成员之一。正常情况下，HuR蛋白主要表达在细胞核，但在多种条件如低氧、放射性损伤和细胞因子等刺激下可从细胞核转运到细胞浆，并改变RNA的空间结构从而抑制脱腺苷化、抑制mRNA募集至外切酶体(exosom)或阻断可识别ARE的核酸内切酶的活性，继而增强mRNA的稳定性［6］。

Denkert等［7］研究了83例原发性卵巢癌、16例卵巢交界性肿瘤、3例正常卵巢组织及9种卵巢癌细胞系(OVCAR-3，SKOV-3，Mdah2774，CAOV-3，ES-2，PA-1，OAW42，A27/80，EFO-27)中HuR蛋白的表达及在细胞内的分布。HuR mRNA和蛋白在所有细胞系中均有表达，免疫组化方法显示HuR蛋白在肿瘤细胞核中阳性表达率为81%，在细胞浆中阳性表达率为45%，并发现细胞浆中HuR阳性率与患者的预后有关，表达高者预后差。本研究发现，在正常卵巢组织、卵巢浆液性瘤组织HuR蛋白相对含量与卵巢浆液性癌比较中差异有统计学意义(P＜0.05)，表明在卵巢浆液性癌的发生过程中有HuR表达增强，同时HuR蛋白的表达与卵巢浆液性癌的淋巴结转移有关，这与Erkinheimo等［2］研究结果一致。因此检测各组卵巢组织中HuR蛋白的表达，有助于诊断和鉴别诊断卵巢良、恶性肿瘤，可以作为间接判断卵巢癌预后的指标之一。同时阻断HuR与一些基因的mRNA 3＇－UTR的结合，可以预防某些肿瘤的发生。

1 Ross J.mRNA stability in mammalian cells.Microbiol Rev，1995，59:423-429.

2 Erkinheimo TL，Lassus H，Sivula A，et al.Cytoplasmic HuR expression correlates with poor outcome and with cyclooxygenase 2 expression in serous ovarian carcinoma.Cancer Res，2003，63:7591-7594.

3 Heinonen M，Bono P，Narko K，et al.Cytoplasmic HuR expression is a prognostic factor in invasive ductal breast carcinoma.Cancer Res，2005，65:2157-2161.

4 Nabors LB，Gillesp ie GY，Harkins L，et al.HuR，a RNA stability factor，is expressed in malignant brain tumors and binds to adenine and uridine－rich elements within the 3＇untranslated regions of cytokine and angiogenic factor mRNAs.Cancer Res，2001，61:2154-2161.

5 Garneau NL，Wilusz J，Wilusz CJ.The highways and byways of mRNA decay.Nat Rev Mol Cell Biol，2007，8:113-126.

6 Wang JG，Collinge M，Ramgolam V，et al.L FA －1 －dependent HuR nuclear export and cytokine mRNA stabilization in T cell activation.J Immunol，2006，176:2105-2113.

7 Denkert C，Weichert W，Pest S，et al.Overexpression of the embryonic －lethal abnormal vision－like protein HuRin ovarian carcinoma is a prognostic factor and is associated with increased cyclooxygenase－2 expression.Cancer Res，2004，64:189-195.