口腔黏膜上皮细胞与猪小肠黏膜下层体外复合培养的实验研究

谭波 魏人前 杨志明 李秀群 韩平 智伟 解慧琪 任燕 谭中侠

（四川大学华西医院 生物治疗国家重点实验室,四川 成都610041）

关于口腔颌面部外伤或肿瘤术后所致的口腔黏膜大面积缺损的修复，传统的治疗方法常利用自体皮片移植法和脱细胞真皮基质（acellular dermal matrix，ADM）修复口腔，以改善其功能，具有较大的局限性。运用组织工程技术构建口腔黏膜，将为口腔缺损的修复提供一条崭新的道路，其基本技术路线包括种子细胞的培养、支架材料的研制、细胞与支架材料的相互作用以及工程化黏膜组织的构建等[1]。小肠黏膜下层（small intestinal submucosa，SIS）是一种具有引导/诱导组织再生的膜材料，有较多实验证实其用于修复重建膀胱、尿道等有良好的组织相容性[2-3]。但SIS在口腔黏膜缺损的应用、口腔黏膜上皮细胞（oral mucosal epithelial cells，OMECs）能否在SIS生长及其与SIS的相容性如何，则很少报道。本研究采用含6%胎牛血清和添加多种成份的上皮细胞无血清培养基（defined keratinocyte serum free medium，DKSFM）为基础培养基，采用酶消化法进行体外连续培养犬OMECs，探索原代及体外连续培养OMECs的方法。通过观察OMECs在SIS上的生长、增殖情况，评价SIS的生物相容性，为组织工程口腔黏膜寻找合适的支架材料。同时,也可为临床上常用于修复腭[4]、角膜、颊黏膜、皮肤的口腔黏膜进一步构建工程化黏膜组织提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 主要材料及仪器

2～5周龄幼犬10只，雌雄不限，体重1～2 kg，由四川大学华西医院动物实验中心提供。DKSFM和Dispase酶（Gibco公司，美国）、胰蛋白酶、胎牛血清（Hyclone公司，美国），口灵（云南三利消毒药业有限公司），细胞培养箱（Sanyo公司，日本），SIS（由四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室的干细胞与组织工程研究室提供），倒置相差显微镜（Olympus公司，日本），荧光生物显微镜（Nikon公司，日本），扫描电镜（Jeol公司，日本），鼠抗人细胞角蛋白CK19单克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司提供）。

1.2 OMECs的分离、培养及生物学性状的检测

1.2.1 口腔黏膜的分离 无菌条件下取幼犬正常口腔黏膜约3 cm×3 cm×3 cm，参照文献[5-7]沿纵轴切开后，将口腔黏膜层与肌层分开，修剪去除肉眼可见的黏膜下组织。聚维酮碘溶液浸泡3～5 min，4 ℃含双抗（含青霉素l00万U·mL-1和链霉素50 μg·mL-1）的PBS反复冲洗，口灵浸泡5 min，PBS反复冲洗并置于4 ℃冰箱内2 h。

1.2.2 OMECs培养 取出1.2.1制备的口腔黏膜组织，将标本浸于含0.22% Dispase分离酶的DKSFM内，置于4 ℃冰箱内过夜消化。使鳞状上皮细胞层与其基底间质分开，随后将鳞状上皮层剪碎置于10 mL 0.22%胰蛋白酶溶液中，37 ℃热消化10 min，将鳞状上皮细胞层分离为单细胞悬液。胎牛血清终止消化，用吸管吹打成细胞悬液，经200目不锈钢网过滤。以离心半径10 cm，1 200 r·min-1离心5 min，弃上清，PBS清洗×3，按每毫升1×105个细胞接种至25 cm2培养瓶，加入培养液（DKSFM加6%FBS）3～5 mL，24 h后首次换液，37 ℃含5%CO2的培养箱中常规培养及传代。传代时，用吸管吸出培养液，4 ℃PBS清洗3次，加入0.25%胰酶37 ℃消化，倒置相差显微镜下见大部分细胞变圆脱壁后，加入含6%FBS的培养液终止消化，吸管均匀吹打板底使细胞脱壁悬浮，将细胞悬液以每毫升1×105个细胞接种至25 cm2培养瓶中继续培养。细胞可传至4～6代，取第2代细胞进行实验。

1.2.3 活细胞观察 用倒置相差显微镜观察原代及传代OMECs的生长状况。

1.2.4 细胞表面标志物监测 收集第2代生长状况良好的OMECs传代于6孔板中培养，分别在4 d和8 d时，以PBS清洗3次，4%的多聚甲醛固定30 min，蒸馏水清洗3次，3%双氧水浸泡20 min。再以PBS清洗3次，加入羊血清室温封闭30 min。吸出血清，以鼠抗人细胞角蛋白CK19单克隆抗体为一抗，37 ℃孵育2 h。然后PBS清洗3次，加入马抗鼠Ⅱ抗室温孵育40 min。显色步骤按博士德公司SABC试剂盒说明书进行，检测CK19抗原的表达。显微镜下观察其结果。

1.2.5 MTT法测绘细胞生长曲线 将第2代细胞消化制成细胞悬液，按每孔1×104个接种于96孔板中，每孔总量200 μL，置37 ℃、5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱内培养，检测孔内加入MTT液，每孔20 mL，培养4 h后，吸出培养基，并加入DMSO每孔150 mL，酶标仪检测各孔光密度值。记录并描绘细胞1～5 d生长曲线。

1.3 OMECs与SIS的复合培养

1.3.1 材料准备 将2.5 cm×2.5 cm的SIS经过环氧乙烷消毒，以3层塑料袋分装密封备用，并将其放入无菌6孔板中，在紫外灯下照射1 h，用DKSFM培养基浸泡2 d，然后向SIS上滴入6%胎牛血清，放入37 ℃、5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱中过夜。

1.3.2 细胞复合培养 将第2代的OMECs用含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，以离心半径10 cm，1 200 r·min-1离心5 min，收集制成细胞悬液。以每孔2×105个将OMECs接种到SIS材料上，放入37 ℃、5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养，每2 d换1次液。分别于4、8 d后检测。

1.3.3 OMECs与SIS复合后形态学观察 OMECs与SIS复合培养4 d和8 d，分别行苏木精-伊红染色，在倒置相差显微镜下观察细胞在材料上的生长情况。

1.3.4 OMECs与SIS复合后石蜡包埋苏木精-伊红染色 分别于复合培养4 d和8 d后，用PBS清洗3次，2.5%戊二醛磷酸缓冲液固定，乙醇梯度脱水，三氯甲烷及石蜡各浸泡30 min等处理后，石蜡包埋，组织切片，切片厚度5 μm，苏木精-伊红染色，观察细胞在材料的黏附、生长、增殖情况。

1.3.5 OMECs与SIS复合后扫描电镜观察 复合培养4 d和8 d后，用PBS清洗3次，2.5%戊二醛磷酸缓冲液固定，乙醇梯度脱水，标本经脱水和喷金处理后，用扫描电镜观察细胞在材料的黏附、生长、增殖情况。

2 结果

2.1 细胞形态

倒置相差显微镜下见细胞悬浮于培养基中，呈球形，明亮、饱满，有折光性，30 min后开始贴壁；12 h内大部分细胞贴壁伸展呈不规则圆形或多边形。1 d后，细胞即开始成簇生长，并可见多处细胞核分裂相；2～3 d，细胞达到生长高峰，细胞体积进一步变大，胞浆丰富，胞核大而圆，颜色较深，4 d后，细胞基本达融合状态，形态、大小均一，密集排列呈上皮细胞特有的铺路石样（图1）。

图1 原代细胞长满后呈典型铺路石样外观倒置相差显微镜×100Fig 1 The primary culture of canine OMECs arranged like slabstone inverted phase contrast microscope×100

2.2 细胞表面标志物检测

细胞行CK19细胞角蛋白免疫组织化学染色后,可见视野中细胞胞浆呈棕黄色，为阳性染色。高倍镜可见胞浆内呈棕黄丝网状角蛋白颗粒（图2）。

图2 第2代犬OMECs的CK19角蛋白阳性染色SABC×200Fig 2 Positive staining of the 2nd passage of the canine OMECs with broadly reacting anti-cytokeratin CK19SABC×200

2.3 细胞生长曲线测绘

由第2代细胞的生长曲线可见，培养1、2 d为对数生长期，2 d细胞生长达到高峰，2、3 d为平台期，3 d后细胞增殖减慢。

2.4 OMECs与SIS复合后组织学观察

OMECs在材料表面黏附生长，苏木精-伊红染色细胞呈多角形，胞核蓝染，胞浆粉红，细胞连接紧密，呈铺路石样，在材料孔隙内也可见细胞生长和增殖（图3）。

图3 OMECs与SIS复合 HE×200Fig 3 The canine OMECs were co-cultured with SIS HE×200

2.5 OMECs与SIS复合后苏木精-伊红染色

染色可见，4 d组部分细胞在SIS基质层表面呈单层生长，细胞扁平，细胞核呈长梭形，细胞之间连接紧密。部分区域形成1～2层的复层上皮样结构，细胞呈方形或椭圆形，细胞核大而圆，胞浆丰富（图4左）。8 d组细胞形态和排列与4 d组相似，但复层上皮样结构增多，少部分细胞有碎裂等老化现象（图4右）。

图4 OMECs与SIS复合 HE×200Fig 4 The OMECs were co-cultured with SIS HE×200

2.6 OMECs与SIS复合后扫描电镜观察

复合4 d，可见上皮细胞多呈镶嵌状排列，表面可见微绒毛和脊样胞浆皱褶（图5左）。复合8 d，细胞与材料复合生长情况良好，细胞在材料上都已大量增长，呈层状排列，细胞连接紧密（图5右）。

图5 OMECs与SIS复合 SEM×400Fig 5 The canine OMECs were co-cultured with SISSEM×400

3 讨论

口腔颌面部的恶性肿瘤及大面积外伤，治疗方法往往以外科手术为主，主要是使用游离皮片或皮瓣的自体组织移植法，其优点在于组织易于存活，无机体排斥反应等，但缺点是自体供皮区取材有限，自体供区和受区的美观和功能又有不同程度的影响。同时一个患者有几处手术区域时，损伤比较大，术后难以修复。由于口腔颌面部的解剖及生理特点，术后患者口腔黏膜组织缺损往往是创口难以缝合或手术后瘢痕挛缩，引起张口受限、咀嚼吞咽困难等不同的并发症。90年代中期出现了一种真皮替代物，用于烧伤整形，近几年其应用领域不断扩展，国内也有学者用于口腔黏膜缺损的治疗[8-9]，取得了较为满意的治疗效果。但是寻找简便、安全、有效的口腔黏膜替代用品已成为治疗口腔黏膜疾患，提高患者生存质量的关键。运用组织工程技术构建有活性的口腔黏膜，将为口腔黏膜缺损的修复提供一条崭新的道路。本研究采用口腔黏膜上皮细胞作为种子细胞构建组织工程化口腔黏膜，选用具有引导/诱导组织再生的膜材料SIS作为组织工程化口腔黏膜的支架材料。

在组织工程化口腔黏膜的种子细胞研究中，李宏卫等[10]采用口腔黏膜上皮细胞和角化细胞培养液培养口腔黏膜上皮细胞，取得了比较满意的结果，但细胞的数量不足，不易传代。范伟杰等[11]采用加10%胎牛血清的人无血清角朊细胞培养基培养原代猪角朊细胞，其细胞连续传代困难，且易老化。韩平等[12]认为上皮细胞无血清培养基去除了血清的影响，其添加物成分明确，能够促进上皮细胞的增长，抑制细胞终末分化，保持细胞体外持续增殖的活力。本研究通过反复实验比较添加不同浓度胎牛血清对OMECs生长的影响，使用含6%胎牛血清和多种添加成份的DKSFM，采用酶消化法进行细胞培养，通过倒置显微镜下动态观察、苏木精-伊红染色、组织化学染色、细胞生长曲线绘制，发现与常规血清培养液培养比较，在DKSFM加6%FBS培养液中，成纤维细胞的生长明显受抑，且口腔上皮细胞生长形态好，活力旺盛，增殖力强，细胞融合快，不易老化，可连续传4～6代。此外，其使用方便，无需特殊配制，添加其他成分少，适合应用及推广。

在组织工程口腔黏膜的支架材料研究中，本研究运用的SIS是由猪小肠制备的天然细胞外基质类生物衍生材料，主要由Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白构成，具有无抗原性，用于移植不会导致免疫介导的炎性反应，有良好的细胞相容性，可促进多种细胞在材料上的黏附、生长和分化，含有多种生长因子，即使经过制备过程处理的SIS仍然含有这些生长因子，如碱性成纤维细胞生长因子、转化细胞生长因子-β、血管内皮细胞生长因子等[13]。本实验用OMECs与SIS在6孔板中复合培养，OMECs在SIS材料表面生长，大量黏附，细胞呈多角形，铺路石样排列，可见中期核分裂相，在材料孔隙内也可见细胞生长和增殖。扫描电镜观察细胞在材料上大量增长，呈层状排列，细胞连接紧密。

综上所述，采用DKSFM加6%FBS培养液进行OMECs的原代培养，细胞生长形态好，活力旺盛，增殖力强，细胞融合快，不易老化，成纤维细胞的生长明显受抑，可连续传代；SIS与OMECs具有很好的生物相容性，可促进细胞在材料上黏附、生长和分化。因此，OMECs与SIS可作为构建组织工程口腔黏膜的理想细胞和材料。

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